雷公藤模型小鼠生殖内分泌改变的实验研究

雷公藤模型小鼠生殖内分泌改变的实验研究

雷公藤是卫矛科植物。它具有驱风、除湿、活血通络等功效。根提取物雷公藤多酚（f.，gtw）广泛用于心血管疾病的治疗。上世纪80年代有学者报道其抗生育活性,之后雷公藤动物模型成为研究生殖减退的有效模型。本研究以雷公藤生殖减退模型小鼠为研究对象,从其生殖功能改变和内分泌激素变化,探讨中医肾主生殖理论的内涵,并用中药补益肾阳药物、补益肾阴药物及补益肾阳药物与补益肾阴药物联合应用,进行干预反证。1材料和方法1.1实验材料1.1.1美国普通四方社学动物开发使用成年BALB/C雄性小鼠104只,体重25g左右。由上海西普尔-必凯实验动物有限公司提供,实验动物许可证号:SYXK(沪)2004-0005;实验动物合格证号0058668。分笼饲养于12h光照,45%左右相对湿度的饲养笼中,自由饮食。1.1.2h测定试剂盒17羟皮质醇、HCG、E2、T、FSH测定试剂盒:北京北方生物技术研究所;雷公藤:上海复旦复华药业有限公司,批号091003,规格10mg×100片。1.2实验方法1.2.1大鼠精子畸形模型实验室条件下适应性饲养1周,随机分为正常组22只,造模组70只,肉苁蓉预处理组12只(同时给予雷公藤多苷30mg·kg-1·d-1和肉苁蓉煎液按照相当于生药10g·kg-1·d-1的剂量0.25mL灌胃)。造模组给予雷公藤多苷30mg·kg-1·d-1灌胃(按照成人1.5mg·kg-1·d-1的20倍计算),正常组给予生理盐水灌胃。3周后造模组和正常组各随机抽取10只雄鼠观察精子状况,与雌鼠合笼1周,观察雌鼠怀孕率,以与正常组比较出现统计学差异(P<0.01)为模型成功。将造模组随机分为模型组、雷公藤组和肉苁蓉组、熟地组和熟地苁蓉组各12只。模型组:给予生理盐水0.25mL,每日1次灌胃。雷公藤组:雷公藤多苷0.03g·kg-1·d-1;0.25mL,每日1次灌胃。肉苁蓉组:肉苁蓉煎液相当于生药10g·kg-1·d-1(按照成人0.5g·kg-1·d-1的20倍计算);0.25mL,每日1次灌胃。熟地组:熟地煎液相当于生药10g·kg-1·d-1(按照成人0.5g·kg-1·d-1的20倍计算);0.25mL,每日1次灌胃。熟地苁蓉组:肉苁蓉、熟地等比例的煎液相当于生药20g·kg-1·d-1(按照成人1g·kg-1·d-1的20倍计算);0.25mL,每日1次灌胃。然后按照上面方法继续灌胃3周,合笼后,雄鼠留取24h尿液,眼球取血分离血清。1.2.2小鼠精子畸形试验(1)一般状态观察及尿液、血清检测。一般状态的观察:饮食、活动、毛色和尿量等。尿液检测:放免法检测绒毛膜促性腺激素(HCG)、17-羟皮质类醇(17-OHCS)。血清检测:放免法雌二醇(E2)、睾酮(T)、促卵泡生成激素(FSH)。(2)雄鼠精子形态观察。颈椎脱臼法处死小鼠,分离附睾,分别置于盛有1mL0.9%生理盐水的培养皿中,将附睾尾剪成小块,用吸管将悬浮液轻轻吹打5~6次,静置3~5min,在悬液中加入1%伊红溶液80μL混匀染色15~20min后,取1滴置于清洁的玻片上,均匀推片,镜检。每只动物观察300个精子细胞。精子畸变类型包括无钩、香蕉形、无定形、胖头、双头、双尾、尾折叠等。(3)雌鼠怀孕率观察。雌鼠与雄鼠合笼后,雌鼠继续正常饲养2周,观察幼鼠及胎鼠,计算怀孕率。(4)脏器指数。睾丸和肾脏脏器指数,脏器指数(%)=器官重(g)/体重(g)×100%。1.2.3方差分析方法计量资料以均数±标准差表示,实验各组之间的比较采用单因素方差分析(onewayANOVA),任意两组之间的比较采用LSD检验;计数资料采用卡方检验。所有统计学处理均由SPSS13.0统计软件完成,P<0.05为有统计学意义。2结果2.1灌服雷公藤3周和6周前后精子畸形率的比较雷公藤模型小鼠附睾中精子密度和活动力大大减少,畸形精子增多,主要表现为头尾分离和顶体弯曲。畸变精子表现为无钩、香蕉形、无定形、胖头、双头、头颈断裂、颈部断端高度卷曲、尾部膨大、双尾和尾折叠等。小鼠灌服雷公藤3周和6周后精子畸形率见表1。小鼠灌服雷公藤3周组与正常对照1组比较,精子畸形率显著上升,有统计学差异,P<0.05;灌服雷公藤6周组与正常对照2组比较,精子畸形率进一步上升,有统计学差异,P<0.01;说明雷公藤的生殖毒性有时间依赖性。2.2各组交配成虫和模型大鼠分娩情况比较前期研究发现,通过给雄鼠不同剂量的雷公藤多苷,观察不同时间点与各组雄鼠交配的雌鼠的怀孕率,发现雌鼠怀孕率随雄鼠服用雷公藤多苷时间延长和剂量增加呈下降趋势。本次实验雷公藤灌服3周模型组与正常组交配雌鼠怀孕率比较有显著差异,P<0.01;雷公藤持续灌服6周雄鼠,交配雌鼠怀孕率为0;肉苁蓉预防组交配雌鼠怀孕率亦为0;肉苁蓉组、熟地组和熟地苁蓉组与模型组比较无明显差异,P>0.05,见表2。经卡方检验,模型组与正常组有显著差异,P<0.01;肉苁蓉组、熟地组、熟地苁蓉组与模型组相比无显著差异。2.3对雷公藤、肉嫩、结构施的影响睾丸脏器指数在各组间有显著差异,模型组较正常组降低,有统计学差异,P<0.01;雷公藤组较正常组降低,有统计学意义,P<0.01,较模型组进一步降低,P<0.01;肉苁蓉组、熟地组和熟地苁蓉组与模型组比较无明显差异,P>0.05;肉苁蓉预防组与雷公藤组比较无明显差异,P>0.05,见表3。2.4肉桃预防组和模型组尿17羟皮质醇含量比较模型组尿17羟皮质醇值与正常组比较有显著差异(P<0.05);肉苁蓉组、熟地组、熟地苁蓉组和肉苁蓉预防组与模型组比较有显著差异(P<0.05),见表4。模型组尿17羟皮质醇含量较正常组明显降低,有显著统计学意义;肉苁蓉组、熟地组、熟地苁蓉组和肉苁蓉预防组相对于模型组均有改善,且有统计学意义,肉苁蓉组、熟地组、熟地苁蓉组和肉苁蓉预防组之间则无差异。2.5肉莎、湿地施、肉纤维模型各组t值、e/t值的比较模型组T值与正常组相比有显著差异(P<0.05),E2/T值与正常组相比有显著差异(P<0.05),熟地苁蓉组T值与模型组相比有显著差异(P<0.05),见表5。模型组T值下降有统计学差异,P<0.05;肉苁蓉组对T值有上调作用,但未达到统计学意义,P>0.05;熟地苁蓉组对T值的上调作用达到统计学差异,P<0.05;模型组E2呈上升趋势,熟地苁蓉组有下调E2的趋势,肉苁蓉有预防E2上升的趋势,但均未达到统计学意义,P>0.05;E2/T值,模型组有升高趋势,肉苁蓉组和肉苁蓉预防组有下降趋势,但均未达到统计学意义,P>0.05;在这组数据中,肉苁蓉组和熟地组未显示出有意义的干预作用。2.6各组尿hcg值比较雷公藤阳虚模型各组FSH值无统计学意义差异(P>0.05);模型组尿HCG值较正常组有显著差异(P<0.01),肉苁蓉组、熟地组、熟地苁蓉组和肉苁蓉预防组尿HCG值较模型组有显著差异(P<0.01),见表6。模型组尿HCG值升高,有显著统计学意义,P<0.01;肉苁蓉组、熟地组、熟地苁蓉组3个干预组和肉苁蓉预防组对尿HCG值均有下调作用,且显示统计学意义,P<0.01;各组FSH值差异无统计学意义,P>0.05。3肉纤维—讨论肾是人体内重要脏腑之一,肾藏先天之精,主生殖,为人体生命之本原,素有“先天之本”之称。肾精,是人体形态结构和生理功能形成的物质基础。肾的精气盛衰,关系到生殖和生长发育的能力。人从幼年开始,肾的精气逐渐充盛,就有齿更发长等变化;发育到青春时期,肾的精气充盛,产生了一种“天癸”的物质,于是男子就产生精子,女子就开始按期来月经,性机能逐渐成熟,而有生殖的能力;待到老年,肾的精气渐衰,性机能和生殖能力随之减退至消失,形体也就逐渐衰老,这就是肾的精气在主持人体生长,发育和生殖功能方面的重要作用。人的生殖功能的发育、成熟、衰退都与下丘脑─垂体─性腺轴的功能有密切关系,它类似于中医“肾”主生殖的全部内容,其中“天癸”应包括了这条轴上各器官所分泌的各种激素及它们相互之间的互为依存,互相抑制的关系。睾丸由曲细精管内的生殖细胞发育成精子,支持细胞合成雌激素,在局部影响精子的生成。睾丸的间质细胞能合成和分泌雄激素,如睾酮、雄烯二酮、去氢异雄酮。睾酮的生物活性最强,能够刺激精细管发育,启动和维持精子发生。FSH促进生精上皮发育和精子产生。HCG促进睾丸发育,并合成与分泌睾酮和雄激素。对于雷公藤引起的生殖内分泌激素的改变有不同的报道。本研究制作雷公藤模型灌胃3周后,出现不同程度的体重下降、弓背蜷缩、行动迟缓、嗜睡、倦怠懒动、反应迟钝、喜扎堆、体毛枯萎等一系列类似中医的肾阳虚症状,正常组小鼠没有上述表现,且模型组尿17羟皮质醇含量较正常组明显降低,提示雷公藤生殖减退模型也是肾阳虚模型。通过补益肾阳药物、补益肾阴药物及联合应用补益肾阳药物和补益肾阴药物进行干预,观察模型小鼠精子形态改变,配对雌鼠怀孕率,睾丸与肾脏的脏器指数,睾酮(T)、雌激素(E2)、促卵泡生成激素(FSH)、尿绒毛膜促性腺激素(HCG)变化,结果发现雷公藤模型小鼠精子畸形率较正常组明显增加,配对小鼠怀孕率明显降低,睾丸脏器指数明显降低;T下降,有显著统计学差异;E2升高,但尚未达到统计学意义;E2/T上升,有统计学意义;FSH变化不明显;尿HCG明显增加,有统计学差异。经肉苁蓉、熟地干预,各项指标均有不同程度改善,以肉苁蓉熟地联合用药作用较