黄连中寒性物质的实验研究

黄连中寒性物质的实验研究

黄连的有效成分主要是各种碱，如小碱、黄连碱、巴氏剂、根碱和表小碱。其中，小碱含量最高，约为5%8%。通过实验检测黄连生物碱和其他成分药理药性作用,前景广阔。1生物技术D101树脂(购于南京),高效液相色谱仪(岛津),KQ5200DA型数控超声波清洗器(昆明市超声仪器有限公司),大鼠(购于重庆腾鑫生物技术有限公司),数字温度计(购于重庆君得莱医疗器械有限公司)。黄连须采自于重庆石柱县,经西南大学药学院李学刚(研究员)鉴定,酵母(购于番禺梅山-马利酵母有限公司制造),药根碱、黄连碱、巴马汀、小檗碱(成都曼思特生物科技有限公司),乙腈为色谱纯,其它试剂均为分析纯。2实验方法2.1流动相乙腈—HPLC色谱条件HypersilODS2色谱柱(4.6mm×250mm,5μm),流动相乙腈—磷酸二氢钾(38:62),流速1mL·min-1,柱温30℃,检测波长343nm,进样量:25μL。2.2对照品溶液的制备精密称取一定量的药根碱、黄连碱、巴马汀、小檗碱,用80%甲醇充分超声溶解,精确吸取1mL置10mL容量瓶中,用甲醇最终稀释成药根碱29.28μg·mL-1、黄连碱18.4μg·mL-1、巴马汀40.08μg·mL-1、小檗碱32.32μg·mL-1的对照品溶液。2.3沉淀沉淀液的制备黄连须用0.5%的硫酸水浸泡24小时,倒出浸提液,沉降泥沙后取其上清液,加氯化钠盐析得到沉淀。将沉淀物和D101树脂按固-固2:1上柱,取沉淀按1:50加沸水溶解,取溶解液按1:100(固-液比)上100mLD101树脂柱,开始从柱上流下的过柱液为无色,当流出液出现黄颜色时开始收集过柱液,经旋转蒸发仪减压浓缩后加氯化钠盐析得复合生物碱。2.4树脂上树脂的蒸发吸附黄连须浸提液饱和后的D101树脂柱上树脂是完全变为黑色的,用工业酒精对D101树脂柱进行梯度洗脱,收集洗脱液,用旋转蒸发仪蒸干后得黑色物质。2.5动物测试2.5.1复合提取液组升温剂的配置,取一定量的干酵母与灭菌水均匀溶解,最终配置成含干酵母20%的水溶液,放置冰箱中备用。清热药物的配置,复合生物碱和黑色物质分别配成600mg·Kg-1、300mg·Kg-1、150mg·Kg-1三个剂量组。每鼠灌胃量0.02mg·mL-1,每只灌胃4mL。2.5.2皮下注射酵母的筛选取32只SD大鼠,雄性,体重在250±10g左右,分为8组,1组空白对照组(不打酵母),剩下7组皮下注射酵母。其中1组为发热组,其余6组为实验药物组。2.5.3复合从皮上注射酵母实验前适应喂养2天后,进行正常体温检测,通过文献知道温度测试大鼠的正常体温变化在36.5~37.3℃。每只大鼠按10mg·Kg-1背部皮下注射酵母2-3小时后,记录当时体温。空白对照组和发热组灌胃生理盐水,其余6组灌胃配置好的药物,分别为600mg·L-1、300mg·L-1、150mg·L-1三个剂量组(复合生物碱)和相同三个剂量(黑色物质)。灌胃后检测各时间段体温,结果如表1。2.5.4统计处理试验数据以±s表示,利用SPSS11.5进行数据统计和方差分析检验。3黑色物质和复合氧化物组温度的变化用HPLC检测黑色清热物质和复合生物碱成分色谱图,结果如图1、2。从上表可知,空白组大鼠体温均在正常范围内。注射酵母后,各组体温与空白对照组在4小时已经有明显升高,说明造模成功。在2.5~4小时内体温迅速上升,发热组有明显的发热趋势,在注射酵母4小时后体温开始上升到高峰,然后体温有逐渐下降,与正常对照组比较,两者之间有显著差异。从灌胃后开始计时,单独对比黑色物质组和复合生物碱组温度随时间变化趋势,如图3、4所示。从图中可知,灌胃1.5h左右温度达到最高,但黑色物质随后的降温效果明显,而复合生物碱组温度基本不变。经过HPLC分析复合生物碱的成分可知,小檗碱、药根碱、巴马亭、黄连碱的含量分别为70.1%、8.4%、6.9%、10.2%;而黑色物质的成分中仅含小檗碱和巴马汀仅占3.72%,不含其他生物碱。因此,推断用来降低大鼠体温的物质不是黄连生物碱,而是黄连中的大寒性物质,这种寒性物质的成分还不确定,有待进一步实验分析认定。4麻黄须中原则通过本实验,能够将黄连须中的复合生物碱和构成黄连寒性的黑色物质分离。实验结果显示,黄连须中生物碱虽有抗菌作用但没有清热降温作