蛋白质组学的研究进展

蛋白质组学的研究进展

众所周知，自20世纪90年代初以来，巨大的人类组织计划取得了巨大的成功。10多个低等模式生物的基因组序列测定已经完成:第一个多细胞生物——线虫基因组的DNA全序列测定在1998年底完成;人类基因组序列草图已经绘制完成。但是,由于基因的主要功能是通过其表达产物——蛋白质来实现的,因此人类要揭示整个生命活动的规律,就必须研究基因的产物——蛋白质。蛋白质具有自身特有的活动规律,随着生命活动的进程表现出极其动态的紧密协调的变化,蛋白质在合成之后具有相对独立的修饰、转运和相互间作用能力,同时还具有对外界因素发生反应的能力。因此,只有从蛋白质组学的角度对所有蛋白质的总和进行研究,即开展蛋白质组学研究,才能更加贴近对生命现象和本质的掌握,生命活动的本质和活动规律才能找到答案。1蛋白质组学研究理论蛋白质组(Proteome)指由基因组编码的全部蛋白质,也可以说是指细胞或组织或机体全部蛋白质的存在及其活动方式。蛋白质组学旨在阐明生物体全部蛋白质的表达模式及功能模式,其内容包括鉴定蛋白质的表达、存在的方式(修饰形式)、结构、功能和相互作用等。从蛋白质组的定义上可以清楚地看出,蛋白质组学不同于传统的蛋白质学科之处在于它的研究是在生物体或其细胞的整体蛋白质水平上进行的,它是从一个机体或一个细胞的蛋白质整体活动的角度来解释和阐明生命活动的基本规律。蛋白质组研究可分为两个方面:一方面是对蛋白质表达模式(或蛋白质组组成)的研究;另一方面是对蛋白质组功能模式(目前主要集中在蛋白质相互作用网络关系)的研究。对蛋白质组组成的分析鉴定是蛋白质组学中与基因组学相对应的主要内容。它要求对蛋白质组进行表征,即实现亚细胞结构、细胞或组织等不同生命结构层次中所有蛋白质的分离、鉴定及其图谱化。此外,尚须比较、分析在发生变化的生理条件下蛋白质组所发生的变化。如蛋白质表达量的变化,翻译后修饰的类型和程度,或者可能的条件下分析蛋白质在亚细胞水平上定位的改变等。双向凝胶电泳(2-DE)和质谱(MS)技术是当前分离鉴定蛋白质的两大支柱技术。通过分析一个蛋白质是否与有抑制功能的蛋白质相互作用可得到揭示其功能的线索。利用大规模酵母双杂交系统,建立相互作用关系的网络图,是目前蛋白质组学领域的研究热点之一。2关于蛋白质的科学研究2.1凝胶电泳和图像分析目前在蛋白质组研究中应用最多的是二维聚丙烯酰胺凝胶电泳(two-dimensionalgelelectrophoresis,2-DE),它也是目前对蛋白质组分辨率最高、重复性最好的分离技术。二维聚丙烯酰胺凝胶电泳的基本原理是根据蛋白质的等电点和分子量大小不同,进行两次电泳将之分离。二维电泳的第一向是等电聚焦(isoelectricfocusing,IEF),分为载体两性电解质pH梯度等电聚焦和固相化pH梯度等电聚焦。其第二向是SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS),一般采用垂直电泳或水平电泳。两种方法的实验结果没有明显的差别,均适用于分子质量在10~150Ku的蛋白质。由于2-DE利用了蛋白质两个彼此不相关的重要性质对其进行分离,因此分辨率非常高,一般能分辨到1000~3000个蛋白质样点。最好的胶可分离得到11000个左右的蛋白质样点。但这与庞大的蛋白质组组分相比远远不能满足需要,因此,样品的制备和发展预分离方法将是很有用的。二维电泳分离后的蛋白质点经显色后才能被鉴定。二维电泳中的显色是一个重要的步骤,常用的显色方法有考马斯亮蓝染色、银染、荧光染色或同位素标记等。其中,银染法是非放射性染色方法中最灵敏的,其灵敏度可达到1ng甚至更低。但最灵敏的还是利用同位素标记,20ppm的标记蛋白就可通过其荧光或磷光的强度而测定。图像分析也是二维电泳研究的重要方面。染色后可用图像扫描仪、激光光密度仪、磷光或荧光测定仪等建立双向凝胶电泳图谱。此外,还要对不同组织、不同细胞表达的蛋白质图谱进行比较,除掉凝胶图谱的纹理和背景,找到表达上差异的蛋白质点,确定有生物意义的蛋白质。近来又出现了一些新的蛋白质分离技术,如多维色谱技术、亲和色谱技术和一维变性聚丙烯酰胺凝胶电泳等,其中最有发展前景的是多维色谱技术。从目前的发展方向看,液相色谱—质谱联用成为蛋白质组学分离技术的一个新的增长点,并越来越受到关注。该技术最突出的优点是对全蛋白质组分进行分析时的歧视效应大大减小,而且可以实现蛋白质分离与鉴定的在线联用,有利于蛋白质组研究的自动化和高通量化。2.2蛋白质鉴定技术2.2.1降解蛋白组活性成分的测序和速度分布由于Edman降解法测序可得到准确的肽序列,是蛋白质鉴定可靠的重要依据,因而成为目前蛋白质鉴定的主要方法。但它存在着测序速度较慢、费用偏高等缺陷。最近,应用细径(内径0.8mm,流速40μl/min)的HPLC柱,Cordwell等能够在100飞摩尔(fmol)的初产率下测得5~10个氨基酸残基的序列。随着Edman降解法在微量测序和速度等技术上的突破,它在蛋白质组研究中可发挥重要的作用。类似Edman的C端化学降解法已研究了多年并有自动化分析仪器问世,但它的反应效率较低,通常需纳摩尔(nmol)样品。2.2.2电离子质谱的发展质谱技术的基本原理是带电粒子在磁场或电场中运动的轨迹和速度依粒子的质量与携带电荷比(质荷比m/z)的不同而变化,从而可以据其来判断粒子的质量和特性。质谱仪一般有进样装置、离子化源、质量分析器、离子检测器和数据分析系统组成。质谱最重要的技术是将被分析的分子变成气相的离子。质谱技术按照样品分子离子化的方式分为电喷雾离子化质谱(electrosprayionizationmassspectrometry,ESI-MS)和基质辅助的激光解吸离子质谱(matrixassistedlasterdesorptionionizationmassspectrometry,MALDI-MS)。在离子化方面,两种质谱都采用“软电离”的方法,即样品分子电离时,保留整个分子的完整性,不会形成碎片离子。这对以前的电子电离方式是一个很大的突破,因为电子电离方式的样品分子必须气化,并与电子直接碰撞,而对于大分子,特别是热不稳定、极性的蛋白质而言,这种电离方式会产生大量的碎片离子,结果图谱谱线多得无法分析。这就是质谱技术出现已久,但没能应用到生物大分子研究的主要原因。因此,当80年代Fenn第一次展示电喷雾离子化图谱时,就引起了轰动。不久,MALDI电离技术也发展起来了。到90年代初,ESI和MALDI已被认为是两种在生物大分子研究中具有重要意义的离子化技术。另外,对于蛋白质和多肽,质谱技术还有一个重要功能就是多肽的测序,即采用串联质谱(Tandem-MS),在第一级质谱得到多肽的分子离子,选取目标多肽的离子作为母离子,与惰性气体碰撞,使肽链中的肽键断裂,形成一系列的离子,即N端碎片离子系列(B系列)和C端碎片离子系列(Y系列),将这些碎片离子系列综合分析,可得出多肽片段的氨基酸序列。Wilm等应用纳喷串联质谱(nano-electrospraytandemmassspectrometry)能在较低的飞摩尔上测得多肽片段序列。质谱法有不少优点,还能用于翻译后修饰的分析(糖基化、磷酰化),但目前只适用于20个氨基酸以下的多肽片段。此外,它还存在固有的局限性,譬如Leu和Ile、Lys和Gln不能区别,有些多肽的固有序列不能用质谱法测定。2.2.3蛋白的分离和测定氨基酸组成分析由于耗资低而常用于蛋白质鉴定。氨基酸组成分析有别于肽质量或序列标签,是利用不同蛋白质具有特定的氨基酸组份的特征来鉴定蛋白质。该法可用于鉴定2-DE分离的蛋白质,应用放射标记的氨基酸来测定蛋白质的氨基酸组份,或将蛋白质转PVDF膜,在155℃酸性水解,让氨基酸自动衍生后,经色谱分离,获得的数据用AACompIdent、ASA、AAC-P1、PROP-SEARCH等软件进行数据库查询,依据代表两组分间数目差异的分数对数据库中的蛋白质进行排榜,“冠军”蛋白质的可信度较大。但该法的速度较慢,所需蛋白质或肽的量较大,在超微量分析中受到限制;且存在酸性水解不彻底或部分降解而产生氨基酸变异的缺点,故应结合蛋白质的其它属性进行鉴定。2.2.4生物表面检测蛋白质芯片(ProteinChip)技术是继基因芯片(GeneChip)技术之后的新一代生物芯片技术。根据芯片表面的不同化学成分,可将蛋白质芯片分为化学表面芯片和生物表面芯片。其中化学表面芯片又可分为疏水、亲水、阳离子、强阴离子和金属离子螯合芯片五种,用于检测未知蛋白,并获取指纹图谱。生物表面分为抗体抗原、受体配体和DNA蛋白质芯片等种类,可显示与之结合的抗原或配体的不同分子量亚型。蛋白质芯片技术是一种高通量、微型化和自动化的蛋白质分析技术,它不需要进行蛋白质分离,只是利用抗体或其它类型亲和探针构成的芯片进行检测,可以同时检测几千种蛋白质,效率非常高。具体方法是首先将一系列的“诱饵”(Bait)蛋白质(如抗体)按照一定的排列格式固定在经特殊处理的材料表面上。然后以我们感兴趣的样品为探针来探查该表面,那些与相应的抗体相结合的蛋白质就会被吸附在表面上。而后把未与抗体结合的蛋白质洗掉,把结合的蛋白质洗脱下来,经凝胶电泳之后通过质谱法进行鉴定。这种技术实际上是一种大规模的酶联免疫分析,可以迅速地将我们感兴趣的蛋白质从混合物中分离出来,并进行分析。蛋白质芯片上的“诱饵”蛋白质可根据研究目的不同,选用抗体、抗原、受体、酶等具有生物活性的蛋白质。2.3蛋白质组学研究内容蛋白质与蛋白质的相互作用是细胞生命活动的基础和特征。这种千变万化的相互作用以及由此形成的纷杂的蛋白质联系网络同样也是蛋白质组学的研究内容,且相应的工作也已经展开。目前的研究方法主要有酵母双杂交系统、表面等离子共振技术等。2.3.1转录激活因子酵母双杂交系统(yeasttwohybridsystem)自Fields和Song建立以来已经成为分析蛋白质相互作用的强有力的方法。该方法仍在不断的完善中,如今它不但可用来在体内检验蛋白质间、蛋白质与小分子肽、蛋白质与DNA、蛋白质与RNA间的相互作用,而且还能用来发现新的功能蛋白质和研究蛋白质的功能,在对蛋白质组中特定的代谢途径中的蛋白质相互作用关系网络的认识上发挥了重要的作用。酵母双杂交系统的建立得益于对真核生物调控转录起始过程的认识。细胞起始基因转录需要有反式转录激活因子的参与。转录激活因子在结构上是组件式(modular),即这些因子往往由两个或两个以上相互独立的结构域构成,其中DNA结合域(DNAbindingdomain,简称为DB)和转录激活结构域(activationdomain,简称为AD)是转录激活因子发挥功能所必需的。单独的DB虽然能和启动子结合,但是不能激活转录。而不同转录激活因子的DB和AD形成的杂合蛋白仍然具有正常的激活转录的功能。DB和AD分别能与多肽X和Y结合,由DB和AD形成的融合蛋白现在一般分别称之为“诱饵”(bait)和“猎物”或“靶蛋白”(prey或targetprotein)。如果在X和Y之间存在相互作用,那么分别位于这两个融合蛋白上的DB和AD就能形成有活性的转录激活因子,从而激活相应基因的转录与表达。这个被激活的、能显示“诱饵”和“猎物”的两个蛋白质之间相互作用的基因称之为报道基因(reportergene)。通过对报道基因表达产物的检测,反过来可判别作为“诱饵”和“猎物”的两个蛋白质之间是否存在相互作用。酵母双杂交技术只能反映蛋白质间可能发生作用,还必须结合其它试验才能确认,尤其是要与生理功能研究结合。虽然如此,该项技术在蛋白质间的相互作用研究、筛选新的蛋白质以及研究蛋白质功能等方面仍发挥着重要的作用。2.3.2spr检测原理目前,表面等离子体共振(SurfacePlasmonResonance)技术已成为了当今一种全新的研究蛋白质之间相互作用的手段。表面等离子体共振SPR生物传感器是利用表面等离子体共振现象和SPR谱峰对金属表面上电介质变化敏感的特点,通过将受体蛋白固定在金属膜上,检测受体蛋白与液相中配体蛋白的特异性结合。SPR技术的特点是测定快速、安全、不需标记物或染料及灵敏度高。其除了应用于检测蛋白质与蛋白质之间的相互作用外,还可检测蛋白质与核酸及其他生物大分子之间的相互作用,并且能对整个反应过程进行实时监测。因此,SPR技术在检测生物大分子特异性相互作用上比传统的方法更具优势,其对基础理论、医学诊断及治疗等都具有十分重要的意义。2.4生物组织学研究是基因组和蛋白质组研究数据的一个重要研究概念,但同时进行部分基因生物信息学(bioinformatics)是在生命科学、计算机科学和数学的基础上逐步发展而形成的一门新兴交叉学科,是为理解各种数据的生物学意义,运用数学与计算机科学手段进行生物信息的收集、加工、存储、传播、分析与解析的科学。生物信息学在基因组学和蛋白质组学的研究中起了特殊的重要作用,因为基因组和蛋白质组研究提供的数据的数量之巨大在生物学史上是史无前例的。而且,蛋白质组比基因组具有更大的复杂性,因而蛋白质组信息学更有挑战性。当前生物信息学已经不仅是高效地进行基因组和蛋白质组数据的分析,而且可以对已知或新的基因产物进行全面的功能分析。例如用生物信息学对质谱得到的肽指纹图谱(peptide-massfingerprinting)分析出了一个新的在进化过程中保守的模序(motif),它对蛋白质的结构和功能具有重要意义。用分子建模(molecularm