蛋白质组学研究的进展

蛋白质组学研究的进展

通过收集完整的生物基因序列，尤其是人类骨髓序列的完成，我们为了解遗传因子在细胞中的功能关系提供了基础，并为人类基因活性和疾病之间的相关研究提供了强有力的基础。但是,由于基因表达往往是通过基因的转录、表达产生一个蛋白质前体,在此基础上再进行加工、修饰,才成为一个具有生物活性的蛋白质,所以同样的一个基因在不同条件、不同时间和空间可能不只有一种相应的蛋白质,可能会有几种,甚至几十种对应的蛋白质存在。另外,这样的蛋白质还需要通过一系列的运输过程,到达细胞内适当的位置才能发挥正常的生理作用。在如此错综复杂的表达过程中,任何一个步骤发生细微的差错即可导致肌体发生疾病。研究表明,基因不能完全决定蛋白质的后期加工、修饰以及转运定位的全过程。近年来人们又发现蛋白质间亦存在类似于信使核糖核酸(mRNA)分子内的剪切、拼接,具有自身特有的活动规律。这种自主性不能从其基因编码序列中预测,只能通过对其最终的功能蛋白进行分析才能了解蛋白质在肌体中发挥的不同作用。正是由于基因组学无法回答这些问题,所以,在人类基因组计划完成后,科学家们又进一步提出了后基因组计划,蛋白质组(proteome)研究便是其中一个很重要的内容。蛋白质组学也正是作为功能基因组学的重要支柱在20世纪90年代应运而生。蛋白质组就是基因组所表达的所有蛋白质,即一种细胞、组织或生物体所拥有的全部蛋白质。它的研究内容包括:(1)针对已有基因组或转录组数据库的生物体、组织或细胞,建立相应蛋白质组或亚蛋白质组数据库(蛋白质表达谱)及其蛋白质组连锁群,即组成性蛋白质组学;识别执行关键生命功能的多蛋白质复合物并分析控制这些多蛋白质复合物的基因调控网络的特征;(2)以重要的生命过程或人类一些重大疾病为对象,进行重要的生理和病理体系或过程的研究,即比较蛋白质组学研究;(3)蛋白质组学支撑技术平台和生物信息学的研究。目前,蛋白质组学研究已在各个方面取得了重要进展,如:蛋白质和肽的分离方法研究;用于对蛋白质和肽进行定量的选择标记方法研究;翻译后蛋白质修饰的表征和相应的快速、准确分析仪器的研制;疾病诊断的生物标志物及其治疗的药靶的选择;药物开发及代谢机理的研究、生理病理研究、环境对蛋白质修饰的影响和疫苗的筛选等等。从蛋白质组学的研究内容看出,要研究人类基因组的功能,首先需要对特定时空和特定环境条件下细胞、组织或生物活体中大约40000个基因所编码的高出其数量2～3个数量级的所有蛋白质进行识别和定量分析;其次还要对翻译后蛋白质的修饰(磷酸化、糖基化、甲基化、乙酰基化等)和加工进行分析,并对相似物进行比较,以确定基因型与环境结合得到的表型。要完成如此巨大的工作量,目前的技术路线主要集中在高效、快速并便于自动化的分离方法;高灵敏度、低检测限、准确和快速的鉴定方法以及完整、可靠并方便检索的数据库。一般用于蛋白质研究的方法及技术路线如下:目前,用于“海量”蛋白质混合物的高效分离方法主要有二维电泳和高效液相色谱两种方法。其中因分离度高并具有直观图谱而被普遍采用的方法为二维电泳,即2DE方法。2DE与质谱联用技术已经成为蛋白质组学研究中一个较为成熟的技术平台,被广泛应用于蛋白质组学研究的各个方面。但由于该技术伴随其诞生所固有的缺陷(即:(1)在二维凝胶电泳图谱上,并不是每个蛋白点所包含的蛋白量都足以用于鉴定蛋白;(2)存在歧视性问题,如对于低丰度蛋白、疏水性蛋白、极碱性蛋白(pI>10)、一些极大蛋白(相对分子质量>200000)和极小蛋白(相对分子质量<8000),二维凝胶电泳还不能够将其很好地显示出来,仅仅只有一些可溶的蛋白被用于研究;(3)费时、费力,而且不容易自动化),因此近几年对该方法进行了一些改进,如对电泳前生物样品进行预浓缩和预分离、分步提取以及对凝胶的染色过程进行优化,但都未有实质性的进展。为了解决这种方法存在的问题,另一种高效分离方法,即高效液相色谱方法(HPLC)获得了愈来愈多的应用,特别是各种模式色谱联用组成多维色谱分离技术逐渐被采用,并与质谱联用以克服二维凝胶电泳存在的缺陷。通常与质谱联用的多维色谱分离方法是基于两种或两种以上不同分离机理方法的优化和组合,其峰容量为最后一种模式色谱对前一种(或几种)模式色谱分离所得的所有馏分进一步分离的色谱峰的总和。分离方法的选择除了根据分离对象和目的的不同考虑不同分离方法以及组合方式外,还应考虑质谱鉴定的要求以及最后从蛋白质数据库检索的需要。由于蛋白质组的庞大和复杂,通常需要对其进行预分离以缩小分离范围,再进一步进行高效分离。本文主要对蛋白质组研究中常用的高效液相色谱分离与质谱联用方法的最新进展进行评述。1液-液-ms法在对生物大分子进行质谱分析时,常用的两种“软”电离源为基质辅助激光解吸电离源(MALDI)和电喷雾电离源(ESI)。为了使蛋白质或肽混合物分离和鉴定能自动进行,一般将电喷雾源的质谱或串联质谱(ESI-MS或ESI-MS/MS)与nL(纳升)级反相高效液相色谱(RP-HPLC)系统联用,避免其他模式色谱(如离子交换色谱)将有害的盐离子带入质谱系统,增大系统噪声,影响检测灵敏度。这种联用技术的出现,使得对复杂体系的蛋白质的在线分离和鉴定达到前所未有的高灵敏度(检测浓度达10-15～10-18mol/L)和分析速度(分析蛋白质速度达每天200～300种),借助于计算机的联机检索,使得对蛋白质混合体系进行高通量筛选和鉴定达到了很高的程度,不仅减少了对复杂、费时和费力的二维凝胶电泳方法的依赖,还在此技术基础上衍生出多种分离鉴定技术,如一维凝胶分离鉴定技术、免疫亲和沉淀-质谱鉴定技术,甚至直接对全细胞裂解液进行液相色谱-质谱分析。现在该技术已经广泛用于生物大分子相对分子质量的测定以及生物体、组织或细胞中蛋白质组的研究,揭示生物体中蛋白质种类、丰度的变化、修饰、降解等与生物体生理和病理之间的关系,为疾病预防和治疗、新药开发以及生命奥秘的认识提供了一种可靠的技术平台。其技术路线为:样品(细胞、组织等)酶解→→酶解多肽混合物→RΡ-ΗΡLC→ΜS,ΜS/ΜS→RP−HPLC→MS,MS/MS序列、相对分子质量等→计算机在线检索→蛋白质鉴定。在一维色谱-质谱联用技术中,一方面要考虑的是分离和质谱鉴定条件的优化,另一方面就是如何使用该技术解决实际问题。Shen等详细讨论了nL级规模的LC-MS中毛细管的内径、长度、多孔与非多孔填料以及流速等对峰容量的影响,发现LC-MS系统对低丰度蛋白质的检测灵敏度随上样量的增大或随流动相流速的减小而增高,这对有限样品量的蛋白质组分析具有重要意义。他们还发现多孔与非多孔填料对多肽的质量回收率没有显著影响,表明在选择色谱填料时应尽可能选择高分离效率的多孔填料。当然,反相高效毛细管色谱柱的装填质量也是蛋白质组学分离技术中需要考虑的关键技术之一。另外,对ESI喷头的孔径也进行了研究,结果表明该技术可靠,重现性好,灵敏度高,适合于做复杂样品的蛋白质组学研究。Vissers等还提出了一种流动相流速可变的“峰阱”色谱接口技术,可保证多肽混合物在分析柱上的完全分离、一级质谱或串联质谱分析,不需要在进行nL级LC-MS/MS分离鉴定时必须采用的分流技术。Laurell等评述了一种固定化酶切的样品制备技术,将这种技术与LC-MS联用可使蛋白质分析的自动化程度和灵敏度更高。Zhang等对不同同位素标记-反相高效液相色谱-质谱法用于蛋白质组定量中存在的问题进行了研究,结果表明:由于标记方法的不同,对标记和未标记的多肽混合物的分离度影响很大,因此对所定量的蛋白质组的影响也很大。Premstaller等还制备了苯-二乙烯苯反相整体色谱柱。当流动相中的三氟乙酸含量从0.1%(体积分数,下同)～0.2%降低到0.05%后,与ESI-MS联用,可测定多肽或蛋白质的相对分子质量,检测限可达fmol,准确度达到50×10-6～150×10-6(50～150ppm)。除了对方法本身的研究外,对LC-MS方法在蛋白质组学各个方面的应用也进行了广泛的研究。Spahr等用LC-MS/MS(quadrupole-timeofflightMS,Q-TOF)对商业收集的男性尿进行了4次分析,采集了1450个MS/MS谱图,匹配了751个序列,鉴定了124种蛋白质。整个实验所用的时间少于采用二维凝胶电泳-质谱分析该样品时所消耗的时间,表明在混合物中鉴定出同样种类的蛋白质时,该方法具有较高的效率。Cunsolo等将RP-HPLC-ESI-MS用于花粉中引起过敏的蛋白质中二硫键的确定以及所含半胱氨酸氧化态的表征,为蛋白质和多肽中二硫键的研究提供了一个新的方法。Shen等用在线LC-MS和LC-MS/MS研究了戒酒硫(一种戒酒药物)治疗酗酒的代谢途径和代谢物,发现了药物的作用位点和作用机理,为该药物的有效利用提供了参考。LC-MS作为一维以及二维凝胶电泳技术的一个重要补充,可用于大脑中神经肽的研究。神经肽控制着大多数生物过程,但其相对分子质量一般为300～5000,用二维凝胶电泳分离较为困难,而用LC-MS则比较容易。据报道,在所分析的老鼠大脑的某个确定区域中已经鉴定出约1500个肽。利用LC-MS/MS方法可对蛋白质相对定量方法进行评估。首先用固相萃取技术提取混合物中同位素特异性标记的半胱氨酸肽,然后对回收物进行序列和相对含量的测定,比较了同位素编码亲和标签技术和稳定同位素标记技术,表明后者更简单、高效和灵敏。该方法还可用于磷酸化的多肽分析。首先将多肽混合物进样到一个内填C18反相色谱填料、内径为75μm的毛细管中,梯度洗脱后直接用离子阱质谱仪或四极杆飞行时间质谱仪检测。一般流动相流速为100～200nL/min,峰的洗脱时间持续10～30s,可以分离并鉴定数以千计的多肽。Coutre等还开发了一种HPLC-ESI-MS技术,直接测定了4种不同膜蛋白的相对分子质量,最高相对分子质量为61000,准确度达到±0.01%。该技术的主要特点是可以鉴定未知蛋白而无需予先对其分离纯化。为了进一步提高分离能力,可首先将样品提取液进行自由流毛细管等电聚焦电泳预分离,然后进行SDS(sodiumdodecylsulphate-polyacylamidegelelectrophoresis)分离,再经过RP-HPLC-MS分离鉴定。该方法不但具有非常高的分离效率,而且不受样品量的限制,并能用于蛋白质复合物的研究,为蛋白质组学用于细胞图谱研究提供了强有力的工具。另外,将反相毛细管液相色谱与高灵敏度、高分离度和高准确度的傅里叶变换离子回旋共振质谱(FTICR)联用,可以用准确质量标签的方法一次表征100000个肽混合物,其肽的质量准确度达1×10-6。该技术不但能进行大规模的蛋白质鉴定,而且没有“歧视性”,并能用于稳定同位素方法准确测定蛋白质的相对丰度。在对生物大分子样品进行分析时,也可以通过RP-HPLC分离提取后,收集各个组分,用MALDI-MS测定不同蛋白质的相对分子质量;然后再将含有生物标记物的馏分进行酶解,用MS/MS对目标蛋白进行鉴定。从一维色谱-质谱联用技术的发展看出,对于不很复杂的体系,该技术可充分发挥快速、灵敏以及便于自动化的特色,它是蛋白质组学研究中值得重视的、简便的方法之一。2二维铬ct与质量分析的联合技术2.1多维质谱鉴定技术对于简单的生物大分子混合物,利用一维色谱分离技术可以达到分离的要求,但对于复杂的多肽混合物往往不能满足分离的需要,这使人们想到多维色谱分离方法。其中的一个方法是根据电荷和疏水性差异,对蛋白质混合物酶解所得的复杂多肽混合物进行离子交换色谱分离后,对收集的馏分再进行反相液相色谱分离,并通过MS/MS对多肽进行序列分析,最后在计算机上利用一种数学算法对所获得的序列与从基因组翻译的蛋白质序列进行比较,确定出多肽所对应的蛋白质。一般的分析技术路线为:样品(细胞、组织等)Τrypsin酶解→多肽混合物进样→SCX阳离子色谱柱(第一维色谱:强阳离子交换色谱分离,阶梯梯度洗脱)强阳离子交换色谱馏分进样→RΡ-ΗΡLC(第二维色谱:RP-HPLC分离,线性梯度洗脱)RΡ-ΗΡLC分离馏分进样→ΜS,ΜS/ΜS(多肽序列分析)→计算机检索(鉴定混合物中的蛋白质)。但Yates研究组所提出的多维色谱分离-串联质谱鉴定技术与上述的技术路线稍有差别。他们是将不同分离模式的色谱柱以串联分离的方式合并于同一色谱柱中进行,即在同一色谱柱的前部分装填强阳离子色谱填料,后部分装填反相液相色谱填料。该方法已被成功地用于蛋白质组学研究,并被称为多维蛋白质鉴定技术(multidimensionalproteinidentificationtechnology,MudPIT),获得了广泛应用,并被详细评述。该方法首先对变性和还原的蛋白质混合物进行酶解得到多肽混合物,然后调节混合物的pH<3,进样到强阳离子交换色谱柱,以阶梯方式增加盐的浓度,依次将某一馏分直接洗脱并进样到反相液相色谱柱上,洗脱除盐后,线性增加乙腈浓度,对在反相液相色谱柱上保留的组分进行梯度洗脱分离,用MS/MS对分离的馏分进行鉴定,得到不同多肽的序列,最后用SEQUEST算法从基因组翻译的蛋白质数据库中进行检索,查找确定与多肽序列相匹配的蛋白质。重复从强阳离子交换色谱分离到计算机检索步骤,就可对全细胞裂解液进行分析。由于该技术是将强阳离子和反相液相色谱填料依次装填在一个纳喷进样针中,而且一个分析周期可检测100多种蛋白质,所以该方法可对样品量较少的蛋白质进行快速分析,适用于蛋白质组学中大规模蛋白质的分离鉴定。利用该方法已经鉴定出啤酒酵母和人的核糖体中新的蛋白质,并鉴定出了啤酒酵母中1484个蛋白质。在对细胞蛋白质组进行定性分析的同时,对其进行的定量研究也在蓬勃开展。Washburn等将代谢标记和MudPIT用于啤酒酵母中蛋白动态范围的研究便是一例。他们首先对啤酒酵母菌株在富含14N或15N的培养基中分别培养,然后将两者的裂解液按1∶1,5∶1和10∶1比例混合并酶解成多肽混合物,用MudPIT分析上述3个混合物中的蛋白质组,获得了准确、可靠的结果,表明该方法可用于一系列微生物,甚至哺乳动物组织培养体系蛋白质组的定量研究。由于MudPIT技术不容易在一维色谱-质谱和二维色谱-质谱之间进行转换以满足不同复杂程度样品的分离鉴定,而对大量简单的样品也无须采用此复杂技术,于是Davis等设计了一种比较简单的多维色谱-质谱分离鉴定技术平台。其基本思想就是将进样、离子交换色谱、预柱、反相液相色谱和质谱鉴定系统用3个六通阀连接起来,可以进行一维或二维色谱分离,并可进行自动或手动进样。该技术具有高的分离效率和分析通量,可用于细胞内、外的蛋白质复合物和亚细胞蛋白质组的研究。由此可得出,针对不同的研究目的和对象,应不断开发新的多维色谱-质谱技术,以满足蛋白质组学发展的需要。2.2微量磷酸肽检测和鉴定用亲和色谱柱对某一类具有特异性亲和力的蛋白质或多肽进行提取,然后进行LC-MS或MS/MS鉴定,确定出蛋白质的种类和修饰位点,其基本技术路线与“2.1”节中的分析技术路线类似。这种方法对研究翻译后蛋白质修饰,特别是磷酸化蛋白质组的研究具有重要意义。因为蛋白质的磷酸化修饰是生物体内最重要的共价修饰方式之一。在人类基因组中,有2%的基因编码了参与蛋白质磷酸化和去磷酸化过程的蛋白激酶和磷酸(酯)酶,基因编码的所有蛋白中大约有30%的蛋白质发生过磷酸化修饰,大多数细胞生命过程的调节都与蛋白质分子中的丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸残基上可逆磷酸化修饰有关。蛋白质的磷酸化和去磷酸化这一可逆过程调节着包括细胞的增殖、发育、分化、信号传导、细胞凋亡、神经活动、肌肉收缩及肿瘤发生等过程在内的几乎所有生命活动。因此,蛋白质磷酸化修饰的研究是蛋白质组学研究中一个非常重要的方面。Ficarro等将固定化金属亲和色谱(IMAC)柱与反相高效液相色谱(RP-HPLC)柱联用构成IMAC-RP-HPLC二维色谱系统,并与电喷雾串联质谱在线联用,对磷酸肽进行亲和提取、分离纯化和位点分析,提出了一个很有希望的微量磷酸肽检测和鉴定的方法。该方法首先将酵母细胞裂解液中磷酸化和非磷酸化的蛋白混合物酶解后,对羧酸基进行甲基化修饰,直接用固定化金属亲和色谱富集磷酸肽,再通过纳喷反相高效液相色谱-串联质谱分析,鉴定出1000多种磷酸化肽。在216个磷酸化肽中确定出383个磷酸化位点,其中60个磷酸化肽为单位点修饰,145个为双位点修饰,11个为三位点修饰。而且,这种方法很容易发展成对差异表达的磷酸化蛋白质进行显示和定量测定的方法。另外,也可对含有磷酸氨基酸残基的多肽进行化学修饰或生物素标记,再通过装填抗生物素键合填料亲和色谱柱进行纯化和MS/MS序列分析,确定出磷酸化蛋白和磷酸化位点。有关多维色谱-质谱鉴定技术在确定磷酸化蛋白质以及磷酸化位点的应用,Mann等做了全面的评述。在蛋白质和多肽的糖基化研究中,亲和色谱-反相液相色谱-质谱技术也具有潜力。Geng等用该方法研究人血清和癌细胞中的糖基化蛋白质。其步骤为:(1)还原和烷基化;(2)对所有蛋白质混合物进行胰蛋白酶水解;(3)用固定化凝集素亲和色谱柱对糖肽进行选择提取;(4)糖肽馏分直接进样到反相液相色谱柱,然后进行梯度洗脱分离;(5)MALDI-MS鉴定反相液相色谱收集的色谱峰馏分;(6)根据肽质量谱进行数据库检索。所分析的糖蛋白包括:(1)已知一级结构的N型糖蛋白;(2)未知结构的N型糖蛋白;(3)用单N-乙酰氨基葡萄糖糖基化的O型糖蛋白。复杂混合物中多肽的鉴定可以通过C-端羧酞酶测序或通过与标准蛋白比较色谱行为和质量进行确定。该方法的优点是能快速确定糖蛋白的类型,缺点是无法区分糖基化异构体。另外,亲和色谱与质谱联用可以分析蛋白质复合物,同时对蛋白质相互作用网络进行研究。Shevchenko等研究了芽殖酵母中蛋白质的相互作用情况。他们首先对53个基因的抗原决定簇进行标记,然后对全细胞裂解液中的相互作用物进行两步免疫亲和色谱分离和鉴定。用38个诱饵蛋白提取了属于19个不同功能蛋白复合物的220种蛋白质;鉴定出一个蛋白质相互作用网络中4个蛋白质被不同功能蛋白复合物所共享。由于该方法所得结果与基因组中广泛使用的双杂交方法所得结果的一致性仅为14%,所以,在蛋白质组研究中,亲和色谱-质谱方法应为双杂交方法的一个重要补充。Sanders等还用多克隆抗体纯化-多维色谱-质谱技术研究了转录因子(TFIID)的作用机理。由于TFIID是TBP(TATA-bindingprotein,TBP)和与TBP有关的14种不同因子组成的多亚单位复合体,所以他们首先用多克隆抗体与每个亚单位作用,免疫纯化TFIID,然后用多维色谱-质谱技术鉴定与TBP有关的蛋白质,鉴定了许多蛋白质-蛋白质复合物,并对其进行了详细的表征。Bures等用脱水胰蛋白酶色谱柱从野生型老鼠和羧肽酶缺失型老鼠(CpE)的神经内分泌组织中提取带有碱性C-端的多肽,对它们进行液相色谱分离和质谱鉴定,表明亲和色谱-反相液相色谱-质谱方法对正常和变异老鼠差异多肽的研究具有可行性。先天性糖基化病会使血清中碳水化合物缺失的转铁蛋白异构体(CDT)增加。为了将CDT从糖基化的转铁蛋白中分离出来,Lacey等提出了在线免疫亲和柱-C4反相液相色谱柱-质谱方法,对血清稀释液进行分离鉴定,不但所需样品量少、灵敏度和分离度高,而且分析速度快,可实现每天分析100个样品的高通量分析。2.3色谱聚焦分离的可行性在用离子交换色谱对生物大分子进行分离时,既可采用盐梯度洗脱,也可采用pH梯度洗脱。但在实验中,人们常常采用盐梯度洗脱,而较少采用pH梯度洗脱。由于选择pH梯度对生物大分子混合物进行分离是基于生物大分子电荷和pI的不同,这与等电聚焦电泳的原理相似。等电聚焦电泳对生物大分子的成功分离已有几十年的历史,那么在离子交换色谱中进行pH梯度分离时是否具有“聚焦”作用,可否达到等电聚焦电泳所具有的分离度和实验可操作性?Sluyterman等从理论上对色谱聚焦的原理进行了分析,并用实验进行了验证,表明色谱聚焦不但可行,而且能达到等电聚焦电泳同样的分离效率。与离子交换色谱分离采用的pH梯度洗脱的差异是:色谱聚焦分离是在离子交换剂的表面形成pH梯度,而不是在流动相中形成pH梯度。色谱聚焦的装置简单,易于操作,并能与反相液相色谱和质谱实现在线联用,其技术路线与“2.1”节中的技术路线基本相同。Chong等已经成功地将色谱聚焦分离与装填非多孔色谱填料的反相液相色谱分离联用技术应用于人乳腺上皮细胞裂解液中蛋白质的分离,并用ESI-TOF质谱进行了在线分析。该方法的特点是容易进行自动化操作,并能制作出包含pI和相对分子质量、类似于二维电泳的蛋白质图谱,因此,提供了一种新的