蜜蜂蜂毒蛋白研究进展

蜜蜂蜂毒蛋白研究进展

蜜蜂蜂蜜是蜜蜂和副病毒分泌的一种淡黄色透明液体，沉积在中毒的中后期，并从中毒的口袋中排出，这是中毒的一部分。工蜂的毒液主要用于防御其它动物对其本身或其巢穴的侵犯,蜂王的毒液则主要用于为取得蜂群内的统治地位而与其它蜂王之间的争斗(Xinetal.,2009)。蜂毒包含多种分子量大小不一的多肽和蛋白,具有多种药理和生物学活性(Gauldieetal.,1976;Banksetal.,1979;ArgiolasandPisano,1985;Kreil,1995;SixandDennis,2000;BukuandPrice,2001;Favreauetal.2006),其组分主要包括活性酶类、多肽类、糖类、脂类、氨基酸类和胺类物质等。目前,科学家研究发现许多蜂毒的毒蛋白在抗炎(Yoonetal.,2008)、抗癌(Sonetal.,2007)、抗菌(Ribeiroetal.,2004)、抗辐射和杀虫(Rossetal.,1987)等方面具有很好效果;且蜂毒主要酶类的高级结构已获得解析,成为其它蛋白高级结构预测的模体。由于蜂毒具有特殊的生物学功能,近年来,国内外科学家已对蜂毒的主要成分磷脂酶A2、透明质酸酶、蜂毒肽、蜂毒明肽、肥大细胞脱粒肽和镇静肽等开展大量研究,并取得重要进展。本文综述了蜂毒的主要成分和功能研究方面的进展,旨在为进一步开展蜂毒领域的研究提供参考。1主要组成和功能1.1意大利蜜蜂pla2基因PLA2约占蜂毒干重的12%,按其来源和生化特性,隶属于胞外分泌型PLA2碱性糖蛋白,是蜜蜂蜂毒的主要活性成分和过敏原。PLA2普遍存在于动物各组织的细胞膜及线粒体膜,水解位点是甘油磷脂分子中第2位酯酰键,可将其分解为溶血磷脂和脂肪酸。PLA2被称为“间接的溶血毒素”,因为它与蜂毒肽协同作用,产生强溶血活性,促使红细胞的溶解(Schmidt,1982;Owenetal.,1990;Kelleyetal.,1992)。目前科家学已对PLA2的基因结构、生化特性和蛋白晶体结构等进行了研究,获得了一系列研究进展。1954年,Neumann和Habermann首次鉴定出意大利蜜蜂蜂毒中存在PLA2。Shipolini等(1974)测定了意大利蜜蜂PLA2的氨基酸序列,共有128个氨基酸,而Kuchler等(1989)从构建的意大利蜜蜂工蜂毒腺cDNA文库推断出PLA2基因具有134个氨基酸残基,Li等(2005)用RT-PCR方法克隆了意大利蜜蜂PLA2基因,测序结果表明其核苷酸序列全长为405bp,编码134个氨基酸残基,并得出该基因包含4个外显子和3个内含子,分子量为14.7kD,其后两者的结果是一致的,修正了Shipolini等(1974)的意大利蜜蜂PLA2具有128个氨基酸的结论。Shipolini等(1974)推测PLA2基因共形成4对二硫键,并确定了其二硫键的位置,然而Scott等(1990)应用X衍射方法获得了意大利蜜蜂PLA2的晶体结构,并与牛胰PLA2的结构进行比较,确定了意大利蜜蜂PLA2的5个二硫键位置,并确定了其Ca2+结合位点和酶活性中心,修正了Shipolini等(1974)提出的4对二硫键的理论。Dudler等(1992)成功地将人工合成的意大利蜜蜂PLA2基因转入到大肠杆菌中进行表达,又进一步用养蜂人的血清作为第一抗体进行初步的Elisa分析,结果表明重组蛋白与天然意大利蜜蜂PLA2基因具有相同的酶活性和免疫活性。沈立荣等(2002;2004)克隆了中华蜜蜂和意大利蜜蜂的PLA2序列后,采用大肠杆菌表达系统将意大利蜜蜂PLA2基因进行表达和制备多克隆抗体,多克隆抗体对表达产物Westernblot分析结果表明表达产物与天然纯意大利蜜蜂PLA2具有相同的活性。Hoffman等(2001)利用亲和层析及离子交换层析的方法从欧洲熊蜂种(Bombusterrestris)的蜂毒中分离出PLA2,并且氨基酸测序表明熊蜂蜂毒PLA2与蜜蜂相似性仅有52.9%。Xin等(2009)通过对红光熊蜂(Bombusignitus)毒腺cDNA文库的ESTs分析,克隆分析了蜂毒PLA2的完整序列特征,并用蜂毒PLA2处理昆虫Sf9细胞,免疫荧光染色表明其结合在细胞膜上,同时水解细胞膜上的磷脂并诱导细胞凋亡。在医学研究中,PLA2具有与治疗类风湿性关节炎和心肌梗死等疾病相关的活性成分,因此具有重要的医药应用价值(Mukherjeeetal.,1994;Eckeyetal.,1997;Nakashimaetal.,2004)。在分子生物学研究中,PLA2可以作为研究脂蛋白中磷脂结构和生物膜的工具酶,同时,已获得的PLA2晶体结构可以作为一种模体,而应用于其它相似毒蛋白高级结构的预测(Hariprasadetal.,2012);其次由于蜂毒PLA2作为蜜蜂的防卫性毒素成分,具有一定的杀虫活性,在生物农药开发方面具有重要的应用价值(Quistad,1988)。综上所述,蜂毒中的PLA2在基因结构、生化特性、高级结构和应用研究等方面已经获得了重要研究进展,这不但为开展其它动物毒素的研究提供了技术指导,也为蜂毒过敏的诊断治疗和蜂疗新药研制提供了理论基础。1.2蜂毒中hraHya约占蜂毒干重的2%~3%,按其来源和生化特性,隶属于糖蛋白,是蜜蜂蜂毒中主要过敏原之一(Kemenyetal.,1983;1984;Kettneretal.,1999),其主要功能是催化透明质酸和硫酸软骨素及动物结缔组织粘多糖聚合物长链中的N-乙酰葡糖胺与D-葡糖醛酸间的β-1,4糖苷键水解,生成透明质酸氨基己糖苷酶(Henrissat,1991;Housleyetal.,2000)。成熟的蜂毒Hya包含349个氨基酸残基,其分子量为40.746kD(GmachlandKreil,1993)。Hya为蜂毒进入动物组织以及为蜂毒的渗透和扩散打开了通道,因其具有很强的生物活性,故被称为蜂毒的“扩散因子”(Habermann,1972)。Hya不同于其它的主要毒蛋白,其在蜜蜂毒囊内的含量从蛹期的后期一直到整个成虫期,Hya都基本上维持在一个相对恒定的水平,其含量不随成年工蜂日龄的增长而变化(Owen,1979)。1940年Chain和Duthie(1940)首次报道了蜜蜂蜂毒中存在Hya,国外的一些科学家相继详细研究了蜜蜂Hya的基因结构、生理生化特性和蛋白晶体结构(Beard,1963;Habermann,1972;Schmidt,1982)。Gmachl和Kreil(1993)构建了毒腺cDNA文库,获得了含有编码Hya完整的基因序列,共1149bp,其编码382个氨基酸残基中编码成熟肽的有349个氨基酸残基,从而确定了意大利蜜蜂的Hya的氨基酸序列;沈立荣等(2002)利用RT-PCR方法成功克隆意大利蜜蜂Hya基因的全长并对其序列进行分析,其结果与Gmachl和Kreil(1993)结果一致。Soldatova和Mueller(1998)将意大利蜜蜂Hya在杆状病毒和昆虫细胞中进行了表达,结果表明其表达产物的活性比在大肠杆菌中表达的活性高。Housley等(2000)也利用杆状病毒和昆虫细胞表达的意大利蜜蜂Hya,获得其晶体结构,并确定了其二硫键位置、糖基化位点、酶活性位点和三维立体构象。Hya可以促进皮下输液、局部积聚的渗出液或血液等的加速扩散而有利于吸收,也有消除水肿和血肿的作用,故其在临床上可作为一种重要的药物扩散剂。Hya常与其它注射液(如生理盐水,肾上腺素和抗生素等)合用以促使皮下注射液被迅速吸收,还可以治疗肠粘连和青光眼、白内障及其并发症、玻璃体视网膜等疾病(MenzelandFarr,1998),并可作为溶栓剂以减轻心肌梗塞及缺血损伤,近年来Hya在治疗肿瘤方面所产生的良好效果,使其在临床上的应用日益普遍(Guedanetal.,2010;Whatcottetal.,2011)。1.3蜂毒肽前体蛋白及诱导活性化合物蜂毒肽又称溶血肽,约占蜂毒干重的50%,是蜂毒中最主要的成分(RaghuramanandChattopadhyay,2007)。蜂毒肽由26个氨基酸残基组成,中间区域具有19个疏水性氨基酸残基,因其分子中存在2个脯氨酸残基和3个精氨酸残基,使其成为一个强碱性肽,其分子量约为2.84kD。蜂毒肽的一级结构具有种间特异性,不同蜂种的蜂毒中获得的蜂毒肽氨基酸长度相同,但序列存在差异。上世纪70年代,国外开始对蜂毒肽分子生物学研究,Kindas-Mugge等(1974)将从蜂王毒腺中提取的mRNA注入青蛙卵中,合成了蜂毒肽前体蛋白(promelittin)。Vlasak等(1983)利用质粒pBR322构建了蜂王毒腺cDNA文库,并以蜂王毒腺总mRNA制作探针进行杂交,获得了蜂毒肽的cDNA,而王关林等(2000)通过RT-PCR方法扩增得到了蜂毒肽前体蛋白的cDNA,测得序列长度为155bp,与Vlasak等(1983)发表的序列完全相同;另外再通过在蜂毒肽序列前引入羟胺裂解位点,以定点诱变的方式构建了诱变蛋白表达载体,该载体与β-半乳糖苷酶部分序列相融合,结果在大肠杆菌中成功地表达了诱变蛋白,为基因工程生产蜂毒肽提供了新途径。朱文赫等(2010)通过GST融合表达系统,高效表达了蜂毒肽基因,解决了蜂毒肽对工程菌的致死问题,并证明人工表达的蜂毒肽与天然蜂毒具有相同的溶血活性,为通过基因工程技术生产蜂毒肽奠定了基础。蜂毒肽具有很广泛的生理功能,可以与生物膜相互作用,引起生物膜性能的一系列生物物理变化,表现出强溶血活性(Lavialleetal.,1980;HinchaandCrowe,1996;PapoandShai,2003),其透过混合脂膜和卵磷脂膜的速度超过任何表面活性剂,故其已经作为一种模型肽,被广泛用于钙调蛋白作用机理、膜的作用机制等方面的研究(Schmidt,1982)。此外,蜂毒肽在抗癌(Winderetal.,1998)、抗菌(Fennelletal.,1968)和抗辐射(Ginsbergetal.,1968)方面也具有很好的效果。1.4蜂毒明肽基因生物活性成分序列的扩增和生物生态学检测蜂毒明肽是蜂毒中第二个重要多肽,约占蜂毒干重的1%~2%。1967年,Haux等(1967)报道了其一级结构,确定其成熟肽是由18个氨基酸残基组成,其分子量为2.035kD,二硫键位置为Cys1~Cys11(第1个半胱氨酸和第11个半胱氨酸)和Cys3~Cys15(第3个半胱氨酸和第15个半胱氨酸)(Schmidt,1982)。1995年,Gmachl和Kleil(1995)克隆了意大利蜜蜂蜂毒明肽的编码基因,其报道的成熟肽序列与Haux等(1967)的研究结果相同。1995年,Gmachl和Kreil(1995)构建了意大利蜜蜂工蜂毒腺的cDNA文库,从其中筛选出前明肽原基因的cDNA序列,并从cDNA推导的氨基酸序列得到意大利蜜蜂工蜂前明肽原共由46个氨基酸残基组成,其中前19个氨基酸残基为信号肽,中间8个氨基酸残基为前肽原,紧接着的18个氨基酸残基为成熟肽,最后一个氨基酸残基为酰胺化所必需的甘氨酸;另外,从意大利蜜蜂基因组中扩增获得了前明肽原基因的全长序列,该基因由3个外显子和2个内含子组成。张素方(2003)和浦升磊(2008)均采用RT-PCR方法克隆了意大利蜜蜂的前明肽原基因cDNA序列,全长均为141bp,其蛋白都是由46个氨基酸组成,预测的分子量都为5.1kD,与Gmachl和Kreil(1995)的结果一致;浦升磊(2008)对意大利蜜蜂蜂毒明肽的原核表达进行了研究,结果表明,大肠杆菌表达产物超声破碎后SDS检测到所表达蛋白质为可溶性融合蛋白。张素方等(2003)和张爱提等(2011)均采用RT-PCR方法对中华蜜蜂明肽基因的cDNA序列进行了克隆,全长均为141bp,其蛋白也是由46个氨基酸组成,表明意大利蜜蜂与中华蜜蜂的蜂毒明肽的cDNA序列是一致的;张爱提等(2011)对其序列进行了生物信息学分析,结果表明蜂毒明肽存在较明显的信号肽序列和跨膜区结构,具有生物抗菌肽的典型特性。综上所述,多种蜜蜂的蜂毒明肽基因编码序列已被克隆出来,其序列相对保守,在不同蜂种间其相似性大。蜂毒明肽可以通过血脑屏障,直接作用于中枢神经系统,它是一种很强的神经毒素(Harbmann,1972;Banksetal.,1976)。低浓度蜂毒明肽可以通过调节肾上腺素的释放,增加学习和记忆功能,并能增加下丘脑的去甲肾上腺素、5-轻色胺和多巴胺的含量,改善心功能,进而能预防全身性心血管衰竭等疾病。另外,由于该毒素能够阻断钙离子通道和激活钾离子通道,对一些受体具有高度的亲和力和选择性,故蜂毒明肽还被用作药理学探针以纯化离子通道蛋白和鉴定离子电流等(Huguesetal.,1982)。1.5肥大细胞脱粒肽原基因的生物学活性MCDP又称401肽,约占蜂毒干重的1%~2%,由22个氨基酸残基组成,分子量为2.48kD(Banksetal.,1976),二硫键位置为Cys3~Cys15(第3个半胱氨酸和第15个半胱氨酸)和Cys5~Cys19(第5个半胱氨酸和第19个半胱氨酸)(Schmidt,1982)。Kummar等(1988)用高分辨率的二维1H-NMR对MCDP进行了分析,其研究表明MCDP的氨基酸序列,二硫键的排列和三维结构同蜂毒明肽类似,但其它研究结果表明它们具有完全不同的生物学活性(Gauldieetal.,1978;RomeyandLazdunsk,1984;Hider,1988)。1995年,Gmachl和Kreil(1995)构建了意大利工蜂毒腺cDNA文库,并从中筛选出了肥大细胞脱粒肽原基因的cDNA序列。张素芳等(2003)首次利用RT-PCR方法克隆了中华蜜蜂和意大利蜜蜂的肥大细胞脱粒肽原基因,序列长度均为341bp,都是由50个氨基酸组成,预测的分子量为5.5kD,并利用杆状病毒和昆虫细胞表达系统成功地表达了该基因。刘军甫(2008)同样利用RT-PCR方法克隆了意大利蜜蜂肥大细胞脱粒肽原基因,与张素芳等(2003)的结果一致,并利用GST基因融合表达系统在大肠杆菌内表达,通过GST亲和层析系统成功地纯化出融合蛋白。MCDP具有两种相互拮抗的生物学效应,一方面,MCDP能使细胞脱颗粒沉淀,释放出组胺和5-羟色胺,具有明显的抗炎作用;另一方面,低浓度的MCDP又可以促使肥大细胞脱粒,进而引起炎性反应;另外,MCDP对中枢神经也有一定的活性(Schmidt,1982)。MCDP具有多种药理学和免疫学效应,特别是其类似于过敏原,因此利用MCDP可用来研究炎症细胞、白细胞以及嗜碱性粒细胞的分泌机制(Buku,1999)。1.6复配的氨基酸序列镇静肽约占蜂毒干重的1%,是蜂毒的主要多肽之一(Gauldieetal.,1976),由25个氨基酸残基组成,其分子量为27.5kD,呈强碱性,二硫键位置为Cys9~Cys20(第9个半胱氨酸和第20个半胱氨酸)。镇静肽的生物活性类似于蜂毒肽,具有镇静、降压、消炎、降体温等药理学活性作用(Gauldieetal.,1976)。Gauldie等(1976;1978)首次从大量的粗蜂毒中分离纯化出镇静肽,随后对镇静肽进行了氨基酸序列测定,结果表明其由24个氨基酸组成。Liu和Vernon(1984)也进行了镇静肽的氨基酸序列测序,在其结果中镇静肽为25个氨基酸,这比Gauldie等测得的镇静肽氨基酸序列末端多了一个脯氨酸。而1984年Vlasak和Kreil(1984)成功克隆了意大利蜜蜂镇静肽原基因cDNA序列,氨基酸推导表明,该基因共由77个氨基酸组成,相对分子量为8.7kD,从cD-NA推断出的成熟肽序列,其结果也是25个氨基酸,与Liu和Vernon结果一致,从而确定了其氨基酸的组成。Zhang等(2003)也克隆了中华蜜蜂和意大利蜜蜂的蜂毒镇静肽原基因的cDNA,全长均为234bp,并利用GST融合表达系统在大肠杆菌