响应面法优化草鱼蛋白的二段酶解条件

响应面法优化草鱼蛋白的二段酶解条件

随着人们健康意识的增强，丰富的鱼类、鱼类和虾逐渐从高质量的餐桌上分离出来，产品额外价值降低。然而，由于这些鱼的蛋白含量丰富，我们对其进行了详细的加工，提高了其附加值具有重要意义。通过酶分解蛋白质来提高产品质量。在本研究中，我们选择了低脂肪鱼，并对反应进行了两个横截面试验。采用胰酶、口感酶和瓜氨酸酶三种酶法，以测定两种算法：酶（e）和下（s）的质量比、酶解温度和酶解时间对蛋白质利用率和养分得率的影响，为其他蛋白酶解工艺的研究提供参考。1材料和方法1.1患者lavauryne、生物酶和果汁草鱼:购于市场(鲜活),去头、内脏,清洗干净,绞成肉糜,置于-18℃冰箱中冷冻,备用.酶制剂:胰酶购于杭州三叶生物化工厂;风味蛋白酶(Flavourzyme500MG)购于Novozymes(诺维信)公司;木瓜蛋白酶购于广州裕立宝生物科技公司.凝胶层析标准样品:GlobinⅢ,GlobinⅡ,GlobinⅠ,GlobinⅠ+Ⅲ,GlobinⅠ+Ⅱ和Globin,均购于Amersham公司,其相对分子质量分别为2512,6214,8159,10700,14404和16949.其他化学试剂均为分析纯,由广州梓兴化学试剂公司提供;去离子水为实验室自制.1.2蛋白质测定方法pHS-25数显pH计,上海精密科学仪器有限公司;KND-2C型蛋白质测定仪,上海纤检仪器有限公司;安玛西亚ÄKTApurifier高效液相层析系统,通用电气公司.应用统计分析软件DesignExpert6.0进行响应面试验的设计及数据分析.1.3酶分解过程酶解工艺流程及酶解条件如图1所示.1.4分析和测量1.4.1蛋白质利用率的测定用凯氏定氮法分别测定上清液和酶解液中蛋白氮含量,并按下式计算:蛋白质利用率(RP)=上清液蛋白氮量原料总蛋白氮量×100%.1.4.2tca的离心回应采用三氯乙酸(TCA)沉淀法与甲醛滴定法相结合进行测定.酶解,离心,取10mL的上清液加10mL20%(质量分数,下同)的TCA,搅匀静置半小时后在4800r/min下离心10min,所得离心上清液记作上清液(TCA).分别用凯氏定氮法和甲醛滴定法测定上清液中的总氮含量和氨态氮含量,则肽氮量和肽得率按下式进行计算:肽氮量=上清液(TCA)总氮量-上清液(TCA)氨态氮量;肽得率=(RP′)上清液(TCA)肽氮量原料总蛋白氮量×100%.1.4.3柱净化层析分离取酶解液2mL与等体积缓冲液混合均匀,混合液经孔径为0.20μL的进口滤膜过滤后,准确吸取50μL滤液上柱(Superdex-peptide-10/300-GL玻璃柱)进行层析分离.洗脱液为0.25mol/LNaCl和pH值为7.2的磷酸盐缓冲液,流速为0.5mL/min.2应用方案的设计、分析和优化2.1模型拟合与方差分析依前期对单酶和双酶的筛选,为尽量提高蛋白质利用率并改善酶解液苦味,第一段酶解选用胰酶和风味蛋白酶以质量比为4∶1的比例进行复配,其中胰酶为胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、羧肽酶等的复合酶,可较彻底地打开蛋白质折叠,便于其他酶作用;风味蛋白酶含内切蛋白酶和外切肽酶,可改善酶解液的苦味.由于水解过程中体系pH值的恒定与否对水解物组分的相对分子质量分布和肽得率影响很小,故酶解在自然pH值下进行.第一段酶解选定底物蛋白质量浓度为56g/L,以蛋白质利用率为响应值,试验因素包括E/S质量比(A)(0.10∶100.00～0.40∶100.00)、酶解时间(B)(1.0～6.0h)、酶解温度(C)(45～60℃).其实验方案与结果如表1所示.表2为响应面二次模型方差分析.从表2中可以看出模型F值为48.53,表明该模型高度显著,P<0.05表明总体上模型因素水平项显著.由统计学计算得出,模型的确定系数值为0.9776,说明方程的因变量与全体自变量间线性关系明显;模型的变异系数值为2.30%,说明模型的精密度好.综合以上各参数表明该实验方法可靠,各因素水平区间设计合理,因此可用该回归模型代替实验真实点对实验结果进行分析.回归模型各项的方差分析结果还表明,A,B,A2,C2,AC,BC项也均为显著项,可判断出各具体实验因子对响应值的影响呈非线性关系.利用旋转试验设计软件得到回归方程如下:蛋白质利用率=74.98+8.22×A+5.77×B+1.29×C-7.82×A2+1.32×B2-9.68×C2-1.04×A×B+2.83×A×C-2.00×B×C.该方程表达了蛋白质利用率与各因素之间的变化规律.图2分别表示E/S质量比与酶解时间、E/S质量比与温度、酶解时间与温度对蛋白质利用率的影响.从图2(a)来看,随E/S质量比增加蛋白质利用率呈上升趋势,当E/S质量比增至0.25∶100后蛋白质利用率增加幅度趋向平缓,这是因为当底物鱼蛋白一定时,所能提供给酶作用的肽键数目是确定的,过多地添加酶对提高蛋白质利用率无贡献.而酶解时间从1～6h过程中,蛋白质利用率呈持续上升趋势,据对单酶酶解过程的观察,蛋白质利用率在酶解时间从0～12h过程中大致会经历快速增长(1～6h)、缓慢增长(6～9h)和平衡态(9～12h)三个阶段.这是因为水解初期,底物鱼蛋白含量较高、酶活性大、产物少等有利因素使蛋白质利用率迅速增大;反应进行到6h左右时,可作用底物含量逐步下降,温度、pH值等因素的影响导致酶活力下降,蛋白质利用率增长趋于缓慢;进入平衡阶段(约9h)后,阻碍水解反应的不利因素进一步发展,将导致水解速度更加缓慢.而本响应面试验中酶解时间上限设为6h,故蛋白质利用率表现为随时间延长而持续增长,与单酶试验的规律一致.从图2(a)还可看出,当E/S质量比、酶解时间水平均较高时,蛋白质利用率也相对较高,且低E/S质量比、长时间与高E/S质量比、短时间作用得到的蛋白质利用率相近.从成本角度考虑,选择低E/S质量比、长时间的工艺比较经济.从图2(b)来看,当温度在53℃时蛋白质利用率较高,而E/S质量比较高时蛋白质利用率高.从图2(c)来看,蛋白质利用率也在约53℃时出现最大值,且在各个温度水平下,随酶解时间延长,蛋白质利用率也越高.对响应面结果利用软件进行最优化分析,在底物蛋白质量浓度为56g/L的条件下,以蛋白质利用率最高为评价指标,确定第一段酶解的最优条件如下:胰酶与风味蛋白酶按4∶1的比例(质量比)复合,E/S质量比为0.30∶100,酶解时间为5.90h,酶解温度为53℃.依此条件进行酶解,得到蛋白质利用率的实际值为82.60%,与预测值83.31%非常接近.这充分反映出该模型具有强大的分析能力,可为实际操作提供良好的指导.2.2肽得率的响应面分析在第一段酶解响应面分析确定的最优化条件基础上进行第二步酶解条件的研究,选定底物蛋白质量浓度为56g/L,以肽得率为响应值.试验因素包括E/S质量比(0.1∶100～0.25∶100)、酶解时间(1.0～6.0h)、酶解温度(50～60℃),相应的试验方案及结果方差分析见表3～4.从表4中可知模型F值为6.11,表明该模型显著,P<0.05表明总体上模型因素水平值显著,因此该试验设计是可靠的.与第一段酶解拟合出的二次回归模型不同的是,第二段酶解拟合为2FI模型,即方差来源与A2,B2,C2三个二次项无关.回归方程各项的方差分析结果还表明,C,AB,BC也均为显著项,利用旋转试验设计软件得到肽得率与各因素之间的变化规律如下式:肽得率=48.48-0.23×A-0.44×B+1.72×C-2.02×A×B+0.016×A×C+1.69×B×C.图3为肽得率的响应面分析.从图3(a)我们可以看出,当酶解时间处于较低水平时,随E/S质量比增加,肽得率呈上升趋势,但当酶解时间处于较高水平时,E/S质量比增加反而使肽得率降低.这是因为在水解初期,大量底物鱼蛋白被迅速水解为小分子肽,使肽得率增加;随着反应进行鱼蛋白含量减少,而产物肽含量迅速上升,由于肽链比鱼蛋白分子短,灵活性高,更易与蛋白酶接触发生反应而进一步酶解成氨基酸,因而使肽得率降低.另外,从图3(a)还可以看出,当E/S质量比较低时,随着时间的增加肽得率呈上升趋势,但当E/S质量比较高时,时间增加反而会使肽得率降低.这同样是因为当酶添加量较多时,酶量相对于底物蛋白过量,肽分子便与底物竞争而被进一步酶解,因而使肽得率减小.从图3(b)可以看出,温度升高有利于肽得率的增加,其原因是温度升高对第一段酶解所加胰酶和风味酶有一定热灭活效果,阻碍其进一步将肽降解为氨基酸,表现为肽得率增加.同时,E/S质量比增加导致肽得率降低,这同样是因为蛋白质断裂为肽的速度小于肽降解成氨基酸的速度.从图3(c)可以看出,当温度低时,随酶解时间增加肽得率有所降低,而温度较高时,酶解时间增加导致肽得率明显增加,其原因是温度较高时蛋白质适度变性,空间结构变得松散,有利于木瓜酶接近,故蛋白质降解为肽的程度大于肽降解为氨基酸的程度,从而使肽得率增加;而温度较低时,未被胰酶和风味酶降解的蛋白质仍维持一定的空间结构,难以被木瓜酶接近,故木瓜酶只作用于灵活性大、空间结构较为简单的肽分子,因而使肽得率降低.对响应面结果利用软件进行最优化分析,在底物蛋白质量浓度为56g/L的条件下,以肽得率最高为评价指标,确定第二段酶解的最优条件如下:E/S质量比为0.12∶100,酶解时间为5.60h,酶解温度为60℃.在结合第一段酶解最优条件的基础上进行两段酶解,最终得到肽得率为55.16%,比预计值52.55%稍高.说明响应面模型可为酶解趋势作出很好的预测.2.3相对分子质量和多肽含量为了测定酶解液所含组分的相对分子质量分布情况,从而得到酶解液中的肽组分含量以进一步验证响应面分析法的准确度.将酶解液上凝胶柱进行分析(凝胶色谱图略),其分析结果见表5.从表5可知,草鱼酶解液组分按相对分子质量大小不同得到7个组分峰,对比标样计算可知,酶解液中肽组分的相对分子质量在714～8790范围内.从表5中还可看出,酶解液中相对分子质量在3870～8790之间的组分最多(53.25%),即说明酶解液中近乎1/2的组分集中于此分子段范围内.通常认为氨基酸残基数在4～10之间的肽为寡肽,而大于10个氨基酸残基的肽定义为多肽,因此可认为酶解液中多肽含量即为53.25%.从凝胶图谱组分分析来看,除去部分蛋白质分子以外,酶解液中多肽含量(53.25%)与通过响应面模型所预测的肽得率(52.55%)非常接近,进一步验证了响应面模型分析的准确性,说明响应面分析法在酶解工艺条件筛选中具有很好的应用价值.3型的预测值和预测值比较采用响应面分析法对复合