链脲佐菌素糖尿病模型的建立

链脲佐菌素糖尿病模型的建立

糖尿病是一种严重的疾病，严重威胁着人类的健康和生活。它是一种以持续性高血糖为特征的内分泌障碍疾病,可导致全身性代谢紊乱并继发眼、肾、神经和心血管等器官的慢性进行性病变,最终引起功能损伤及衰竭。1型糖尿病及其并发症的病因、发病机制尚未完全阐明,预防和治疗仍不完善,干细胞(stemcells)是体内存在的一类特殊细胞,有自我更新和不断增生的能力,又具有多向分化的潜能,只要掌握了胰腺干细胞的特异标志、转化调控机制、培养及分离技术,就可以体外操纵干细胞,进行大量扩增和定向诱导分化,最后将得到能分泌胰岛素的胰岛样细胞,用于治疗1型糖尿病。因此,建立较理想的动物模型研究该病的发病机制和治疗具有重要意义。目前,国内外普遍使用STZ制备糖尿病大鼠动物模型。该项实验根据吴清洪报道的方法,采用简单的腹腔一次注射的方法制备稳定并且可靠的动物模型。1材料和方法1.1实验动物的选择和食物1.4实验大鼠的分组、处理和注射枸杞酸缓冲液采取国内外普遍使用的STZ制备糖尿病大鼠模型,根据徐华等报道,雄性大鼠易于成模,且成模后血糖稳定性好,故选取成熟雄性大鼠用于实验。将所有大鼠(70只)使用代谢笼单只喂养,适应性喂养1周,1周内注意观察大鼠的饮食情况、体质量等健康状况,1周后,选取空腹血糖介于2.92~6.92mmol/L的大鼠为实验对象。将空腹血糖介于2.92~6.92mmol/L的大鼠随机分为4组,实验组(60只)分别接受STZ液一次性腹腔注射,剂量为30、65、100mg/kg,对照组(10只)注射枸橼酸三钠-枸橼酸缓冲液。实验前大鼠禁食、水12h。分别于注射后3、7、14、28d采用剪尾法采集血样,用拜安易血糖仪检测空腹血糖,7d后空腹血糖>16.65mmol/L,出现多饮、多食、多尿和消瘦症状的大鼠判定为1型糖尿病动物模型。1.5饮水量及体质量减轻状况观察大鼠造模后的成活数量变化,大鼠的一般状况、饮水量及体质量减轻状况;观察给药3、7、14、28d血糖浓度的变化,第28天时,将大鼠麻醉后心脏取血,检测成模后糖尿病大鼠血清胰岛素及C肽值。1.6数据处理比较实验结果用SPSS13.0统计学软件进行数据处理,所得数据用均数±标准差(x珋±s)表示,两组间比较用t检验,P<0.05为差异有统计学意义。2结果2.1模血糖值检测对实验组大鼠分别注射STZ30、65、100mg/kg后,观察注射后7d空腹血糖浓度>16.65mmol/L,出现多饮、多食、多尿等典型症状。观察实验组和对照组发现,注射STZ30mg/kg组和对照组大鼠的血糖未见明显升高,故此两组均未达成模血糖值。注射STZ100mg/kg组1周后,大鼠有15只死亡,测剩余5只大鼠的血糖值均>33.3mmol/L,出现明显的消瘦,在注射的2周内死亡。注射STZ65mg/kg随着病程的进展,逐渐出现“三多一少”的典型症状,并伴有毛发失去光泽、脱毛、瘙痒、活动减少等表现,注射后给予充足饮水及食物,每日换垫料1~2次,保持干燥,但仍有3只出现烂尾,观察28d后,实验组注射STZ65mg/kg大鼠的体质量减轻22%,饮水量增加约150%(表1)。2.2空腹血糖检测结果注射STZ65mg/kg实验组(20只)与对照组(10只)大鼠给药3、7、14、28d的血糖浓度变化(表2)。实验组大鼠自注射STZ65mg/kg后3d时,出现多饮、多尿等糖尿病典型症状,空腹血糖即出现明显升高,与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。随着饲养时间延长,各时间点的血糖值差异无统计学意义(P>0.05),说明大鼠造模成功后血糖无回退,比较稳定。这表明空腹腹腔注射剂量为65mg/kg的STZ,能明显破坏正常大鼠胰腺功能,胰岛素不能正常分泌,可引发糖尿病。2.3stz注射14d,stz注射20d时大鼠血糖值变化注射STZ65mg/kg实验组18只大鼠成模,成模率为91.67%,STZ注射14d与20d时,实验组3只大鼠死亡,为血糖值较高的3只大鼠,死亡率为16.67%。2.4组患者术后血糖及血脂指标对比注射STZ65mg/kg实验组大鼠,观察28d后,测胰岛素和C肽,与对照组相比P分别为0.045和0.038,均P<0.05,差异有统计学意义(表3)。3讨论3.1糖尿病大鼠模型制备方法近年来,糖尿病的患病率在全球呈现快速增长的趋势,我国人口患病率已达3%。胰岛移植结合使用非糖皮质激素治疗糖尿病目前备受关注,但胰腺供体匮乏,无法满足所有糖尿病患者的需求。建立动物糖尿病模型的方法很多,有实验性动物模型、自发性动物模型和转基因动物模型等,其中实验性动物模型最常用。吴凤丽等认为低剂量的STZ可使易感动物的胰岛细胞产生持续性破坏,并诱导免疫系统产生自我耐受,打破自稳状态,引起胰岛细胞的破坏,自身抗原进一步释放,形成持久稳定的1型糖尿病模型。徐华等采用一次性腹腔注射STZ65mg/kg成功制备了1型糖尿病大鼠模型。用STZ制备大鼠糖尿病模型的剂量范围在30~100mg/kg,该项实验选用Wistar大鼠各20只,一次性腹腔注射不同剂量的STZ,10只对照组注射枸橼酸三钠-枸橼酸缓冲液方法,探讨制备大鼠模型的有效方法。常用的STZ致大鼠糖尿病的成模标准:(1)STZ注射后48h,血糖>16.65mmol/L;(2)STZ注射后第4天,血糖>20mmol/L;(3)STZ注射后第4天起,血糖连续2次>20mmol/L;(4)STZ注射后第7天,血糖>16.65mmol/L。鉴于实验周期较长,对动物模型稳定性要求较高的特点,该项实验选用(4)标准。注射STZ30mg/kg组、100mg/kg和对照组,大鼠的血糖未达成模血糖值。注射STZ65mg/kg的实验组大鼠,随着病程的进展,逐渐出现多饮、多食、多尿的典型症状,并伴有明显的脱毛等体征表现。注射STZ65mg/kg实验组大鼠造模成功,其中18只大鼠成模,成模率为91.67%,STZ注射14d与20d时,实验组3只大鼠死亡,为血糖值较高的3只大鼠,死亡率为16.67%。近年来随着干细胞移植工程学的迅速发展,胰腺或胰岛移植在治疗1型糖尿病中获得一定的效果,因此1型糖尿病大鼠模型的制备,为组织化学胰岛干细胞移植提供了新思路,实验组大鼠自注射STZ65mg/kg后3d时,出现多饮,多尿等糖尿病典型症状,空腹血糖即出现明显升高,与对照组比较(P<0.05)差异显著。随着饲养时间的延长,各时间点的血糖值差异无统计学意义(P>0.05),说明大鼠造模成功后血糖无回退,比较稳定。这表明空腹腹腔注射剂量为65mg/kg的STZ,能明显破坏正常大鼠胰腺功能,胰岛素不能正常分泌,可引发糖尿病。腹腔一次注射STZ65mg/kg可成功制备稳定、可靠的1型糖尿病大鼠模型,为糖尿病的治疗奠定基础。通过对糖尿病大鼠的喂养,除在实验方法中提到的,还要注意以下三点:(1)枸橼酸缓冲液和STZ需要低温下保存,配制新鲜。(2)注射STZ后,观察2h左右,充足饮水及进食。(3)糖尿病大鼠多尿时,至少1天更换1~2次垫料,预防疾病发生。SDF级成熟Wistar雄性大鼠70只(体质量220~280g),购自内蒙古大学实验动物中心,饲养室内氨浓度<20g/L,相对湿度40%~70%,室温18~25℃,保证良好的通风,避免增加造模后大鼠的感染概率,普通饲料喂养,饮水自由。1.2yer公司和stz公司拜安易血糖检测仪及试纸(美国Bayer公司);STZ(美国Sigma公司);胰岛素、