高产-亚麻酸菌株的诱变选育

高产-亚麻酸菌株的诱变选育

i-氨基丙烯酸（i-氨基丙烯酸）是纯顺-6、9、12-18碳三烯酸，格式为c18h30救国。γ-亚麻酸是人体必需脂肪酸,它作为功能性物质前列腺素的合成前体而显示出多种生理调节作用,是现代保健食品和化妆品中不可缺少的重要成分。其主要生产方法有植物种子提取法和微生物发酵法。微生物发酵法生产γ-亚麻酸的关键和前提是菌种的生产性能。据文献报道,深黄被孢霉(Motierellaisabellina)和雅致小克银汉霉(Cunninghamellaelegans)发酵生产γ-亚麻酸的潜力较大。本文以深黄被孢霉(As3,3410)和雅致小克银汉霉(As3,2717)为出发菌株,采用物理和化学诱变法对其进行诱变筛选,以期得到γ-亚麻酸高产突变株。1材料和方法1.1材料表面1.1.1病毒出发菌株深黄被孢霉(As3,3410)、雅致小克银汉霉(As3,2717),购于中国科学院微生物研究所。1.1.2培养基配方PDA固体培养基:马铃薯汁,20%;葡萄糖,2%;琼脂,1.5%。液体培养基:葡萄糖,60g/L;尿素,6g/L;(NH4)2SO4,5g/L;酵母膏,3g/L;磷酸二氢钾,5g/L;MgSO4,1g/L;柠檬酸钠,4g/L;柠檬酸,1g/L;吐温80少许。发酵培养基:葡萄糖,60g/L;硫酸镁,0.3g/L;(NH4)2SO4,3g/L;酵母膏,0.3g/L;磷酸二氢钾,3g/L;硫酸亚铁,20μg/L;氯化钙,20μg/L;硫酸铜,0.4μg/L;硫酸锌,2μg/L;氯化锰,2μg/L;柠檬酸钠,12g/L;柠檬酸,3g/L;吐温80少许。1.1.3ticb健康MJ-160BSⅡ霉菌培养箱,MoticBseries显微镜,LDZX-40BⅠ型立式自动电热压力蒸汽灭菌器,岛津GC-14B气相色谱仪。1.2方法1.2.1细菌激活将保存的As3,3410和As3,2717接种于斜面培养基上,28℃恒温培养4~6d。1.2.2菌种培养和培养将深黄被孢霉As3,3410和雅致小克银汉霉As3,2717划线接入到固体马铃薯平板培养基中,放置在28℃的恒温培养箱中培养5~6d。向平板中加入10mL无菌水和灭菌玻璃珠振荡,洗下孢子制成菌悬液。取1mL菌悬液接入装有9mL液体种子培养基的50mL三角瓶中,28℃的恒温培养。培养期间,定时取出该培养液制成水浸片,在显微镜下观察,待孢子发芽时即为发芽孢子悬浮液。1.2.3菌悬液的制备发芽孢子悬浮液倒入到一干净灭菌的平板中,加入一颗磁力搅拌棒,放置在15W的紫外线灯管下照射,同时打开磁力搅拌器搅拌,使得菌体能够得到均匀的照射,时间为20~30min。照射完毕后放置在暗处进行暗培养3h。将暗培养后孢子制成浓度分别为10-3、10-4的菌悬液。再分别取一滴接入到固体马铃薯平板培养基中,置于28℃的恒温培养箱中培养。1.2.4菌悬液的制备向装有4mL发芽孢子悬浮液的三角瓶(50mL)中加入0.3mL的硫酸二乙酯和16mL的磷酸缓冲溶液,于25~28℃恒温振荡培养1h后取出。制成浓度分别为10-3、10-4的菌悬液。取菌悬液1滴接入到固体马铃薯平板培养基中,放置于28℃的恒温培养箱中培养。1.2.5菌悬液的制备采用诱变前后菌落计数法计算。将发芽孢子制成浓度为10-3、10-4、10-5的菌悬液。再分别吸取10-3、10-4、10-5浓度的菌悬液接入到固体马铃薯平板培养基中,每个浓度的菌悬液涂布3个平板,且每个平板中的每种菌液只滴入一滴,然后放置于28℃的恒温培养箱中培养,菌落计数即为诱变前菌落数。1.2.6k染色法突变株的初筛采用Sudanblack染色法。取菌丝体进行染色,在高倍镜下观察,细胞内脂肪粒被染成蓝黑色,选取菌丝体内脂肪粒大且多的菌株进行复筛。1.2.7生物量的测定采用摇瓶发酵法,依据生物量、油脂含量以及γ-亚麻酸含量来确定目标菌株。菌体生物量的测定。摇瓶发酵4~5d后的培养物,抽滤,并用蒸馏水洗涤菌丝3次,抽干,60℃烘干至恒重,测得生物量(干重)。油脂含量的测定。采用索氏称取法。取2g经研磨的干菌丝体进行索氏提取。提取完毕后,使提取管中的乙醚刚刚接近虹吸管,然后取下提取瓶,在43℃恒温槽中挥发溶剂,然后定量转移到已知质量的称量瓶中,再蒸发至恒重,称质量。用气相色谱法检测所得油脂中的成分,确定γ-亚麻酸的含量确定目的菌株。1.2.8ffap-ames-gc-ms分析试样处理。取试样两滴于试管中,加2mL氢氧化钾甲醇在30℃水浴甲酯化10min,加入2mL正己烷萃取,水洗正己烷层,进样。进样量1.0μL。色谱仪器工作条件。采用岛津GC-14B气相色谱仪分析油脂组成。FFAP毛细管柱,柱长30m,内径0.25mm。测定条件:柱温205℃,气化室温度260℃;检测室温度260℃。对照样品为γ-亚麻酸甲酯(99%)。2结果与讨论2.1菌种生物量和总脂含量测定As3,3410和As3,2717斜面保藏菌种接入PDA培养基28℃活化4~6d,接入液体种子培养基28℃培养2d,再接入液体发酵培养基28℃摇瓶培养4d,菌体分离后60℃干燥至恒重,测定生物量和总脂含量。As3,3410菌丝体得率略低于As3,2717,但菌丝体总脂含量高于As3,2717(表1)。2.2不同培养条件对as3,337的芽孢杆菌芽孢发育的影响霉菌生长周期长,有菌丝生长和孢子生长两个不同时期,且孢子壁较厚。因此霉菌诱变比较困难。霉菌诱变的最佳时期是培养到孢子发芽,而且芽的长度为孢子的1.5倍时。将As3,3410和As3,2717的孢子接入液体种子培养基,分别于28℃静止和摇瓶培养,显微镜下观察其孢子发芽情况。结果发现,在相同培养时间下,As3,2717的发芽率比As3,3410略高;静止培养36h或摇瓶培养4~5h,两株菌的孢子发芽率均达到90%左右(表2)。2.3变过程中as3,2430和as3的致死率紫外线诱变采用以下路线:菌体→活化→液体种子培养基→发芽→紫外线诱变→稀释→涂布平板→分离。紫外线诱变过程中As3,3410和As3,2717的致死率分别为98.7%和98.9%(表3)。获得了突变菌株U3,3410-1、U3,3410-2、U3,3410-3、U3,3410-4、U3,3410-5、U3,3410-6、U3,2717-1、U3,2717-2、U3,2717-3、U3,2717-4。2.4硫酸二乙酯的诱变效果化学诱变采用以下路线:菌体→活化→液体种子培养基→发芽→化学诱变→稀释→涂布平板→分离。化学诱变采用硫酸二乙酯为诱变剂。硫酸二乙酯易分解而引起环境pH改变,因此采用缓冲液配制。本实验诱变剂量是0.3mL的硫酸二乙酯和16mL的磷酸缓冲溶液,诱变时间1h。由于诱变剂与液体种子培养基的极性差别较大,因此诱变时充分振荡,保证孢子和硫酸二乙酯的充分接触。化学诱变过程中As3,3410和As3,2717的致死率分别为99.3%和99.5%(表4)。获得了突变菌株H3,3410-1、H3,3410-2、H3,3410-3、H3,3410-4、H3,3410-5、H3,2717-1、H3,2717-2、H3,2717-3、H3,2717-4、H3,2717-5。2.5突变株与原始菌株产脂量的比较取上述20个突变株的菌丝体进行Sudanblack染色,在高倍镜下观察,细胞内脂肪粒被染成蓝黑色,选取菌丝体内脂肪粒大且多的菌株U3,3410-1、U3,3410-4、H3,3410-1、H3,3410-5、U3,2717-3、H3,2717-3、H3,2717-5进行发酵培养,提取总脂。结果见表5。表5显示,7个突变株中有2株菌体生物量和产脂量都明显高于出发菌株。经硫酸二乙酯化学诱变所得的突变株H3,3410-5(图1)和出发菌株深黄被孢霉As3,3410相比,菌体生物量提高了14.6%,产脂量提高了4.8%。经紫外诱变所得的突变株U3,2717-3(图1)和出发菌株雅致小克银汉霉As3,2717相比,菌体生物量提高了15.4%,产脂量提高了7.2%。2.6突变株的确定采用气相色谱法对H3,3410-5和U3,2717-3所产油脂中的γ-亚麻酸进行分析,并与出发菌株进行对照,列表于6(色谱图略)。结果显示,经硫酸二乙酯化学诱变所得的突变株H3,3410-5所产γ-亚麻酸比率比出发菌株深黄被孢霉As3,3410提高了14.4%;经紫外诱变所得的突变株U3,2717-3所产γ-亚麻酸比率比出发菌株雅致小克银汉霉As3,2717提高了16.1%。本研究所得突变株中,H3,3410-5产γ-亚麻酸比率最高,为9.43%。3菌株产脂量检测结果以深黄被孢霉As3,3410为出发菌,采用紫外线诱变和化学诱变,得到11株突变株,经初筛选取4株用摇瓶发酵法进行复筛,得到H3,3410-5