不同血管内皮功能损伤程度及抗高血压药物对shr大鼠的修复作用

不同血管内皮功能损伤程度及抗高血压药物对shr大鼠的修复作用

血管内皮细胞是分布在所有血管内侧的单个纵细胞。它们穿过全身的系统，通过自身调节和微血管环境的调节，来维持血管的健康。大量实验已充分证明,健康的血管内环境是构筑抵御心血管疾病的基础防线,内皮细胞的健康与否直接关系到血管内环境的稳定,而血管内皮功能不全(endothelialdysfunction)是多种心脑血管疾病的共同病理机制,其突出表现为内皮依赖性血管舒张功能受损。自发性高血压大鼠(SHR)是遗传性高血压动物模型,与人类原发性高血压形成机制有相似之处,已有报道表明SHR存在血管内皮功能障碍,具体表现在离体动脉ACh浓度依赖性舒张作用比正常大鼠减弱。病理学切片显示,SHR主动脉壁有中膜增厚,内皮脱落的现象,但在SHR大鼠中,随大鼠年龄增加内皮细胞损伤的动态进程如何,不同类型的血管如大动脉和中、小动脉内皮损伤发生的时间及程度是否一致,抗高血压药物对其内皮损伤的恢复情况等尚缺乏系统的研究,本研究比较SHR胸主动脉、肠系膜上动脉和心尖小动脉3种不同类型的血管,研究其随年龄增大,内皮功能的变化情况,并应用卡托普利干预,考察药物对前两类血管内皮功能的修复情况,进一步探讨高血压发病进程中内皮功能障碍的发生与改善机制。1材料和方法1.1材料表面1.1.1实验动物清洁级♂SHR和WKY大鼠均购于上海斯莱克实验动物有限责任公司。1.1.2无机试剂及福尔马林卡托普利由中美上海施贵宝制药有限公司提供(批号:0809031)。乙酰胆碱(acetylcholine,ACh)、Phenylephrine(PE)、Forskolin(FSK)等均购于Sigma公司,NaCl等无机试剂均为国产分析纯。Krebs-Henseleit(K-H)工作液(mmol·L-1:NaCl118,KCl4.7,KH2PO41.2,MgCl21.2,NaHCO325,CaCl22.5,Glucose11,pH=7.4)。福尔马林溶液(10%中性甲醛)。ALC无创鼠尾动脉血压测定系统(上海奥尔科特生物科技有限公司),PowerLab八通道多功能生理记录仪(ADInstruments公司,澳大利亚),PowerLab血管功能测定系统(ADInstruments公司,澳大利亚),石蜡切片机(LeicaRM2126中国),正置显微镜OlympusBX51日本)Moticam1300摄像系统(Motic公司,中国)1.2方法1.2.1灌胃卡托普利小型36只6wk龄SHR,随机分为空白组和卡托普利组,适应环境1wk后灌胃卡托普利(蒸馏水溶解,3.375g·kg-1·d-1)至24wk龄,停药后继续观察至32wk龄。18只对应年龄的WKY做空白对照。各组6、18、24和32wk龄时各处理一批(n=6)。1.2.2血压测定大鼠给药及停药期间,用无创鼠尾动脉血压测定系统实时监测血压变化。6、18、24和32wk龄处理之前再用颈动脉插管法测定血压。1.2.3不同年龄shr皮肤整体功能研究1.2.3.动脉和心尖组织动物处死后,分离WKY和SHR的胸主动脉、肠系膜上动脉(离主动脉分支点1cm处)和心尖组织,甲醛溶液固定。HE染色后,观察各类动脉中膜增厚、内皮脱落情况。1.2.3.血管张力检测所有WKY和SHR大鼠处死后,分离胸主动脉和肠系膜上动脉置Krebs-Henseleit缓冲液(K-H液)中,清除血管周围组织后,将肠系膜上动脉剪成3mm左右的血管环。挑选长度相当的两条分别置于5ml体积37℃恒温浴槽内,槽内不断充入0.95O2和0.05CO2的混合气体。血管环一端固定于槽底,另一端连接张力换能器,胸主动脉每条血管环给予2.0g拉力,肠系膜上动脉给予1.5g的静息拉力,20min换液1次,平衡60min。60mmol·L-1的KCl预收缩两次后加入1μmol·L-1浓度的PE收缩,待血管拉力达到坪值后,加入梯度浓度的ACh(10-9、10-8、10-7、10-6、10-5mol·L-1),观察血管随ACh加入的舒张情况。以FSK1μmol·L-1的舒张程度作为百分百舒张,根据10-5mol·L-1浓度ACh的舒张度判断内皮完整性。1.2.4处理数据血压值结果用SPSS11.0软件分析;t检验血管环ACh10-5mol·L-1浓度舒张反应差异。2结果2.1颈动脉插管测定血压整个实验期间,无创鼠尾动脉血压测定系统实时监测大鼠血压变化(数据未给出)。6、18、24和32wk处理时颈动脉插管测定血压结果如Fig1。结果显示SHR在6wk血压已经开始升高,在18wk已趋于稳定。给予卡托普利可降低SHR血压,停药后该作用消失,血压上升至SHR空白水平。2.2卡托普利对shr血管形态的影响病理切片显示,WKY胸主动脉管壁中膜在6、18、24和32wk均无增厚,但32wk内皮细胞部分脱落(Fig2A);肠系膜上动脉和心尖小动脉在整个观察期间内皮细胞完整且排列紧密,中膜无增厚(Fig2B、C)。SHR18wk以后胸主动脉管壁中膜均比WKY增厚,同时内皮细胞部分脱落(Fig2D);肠系膜上动脉也表现为18wk以后中膜增厚,24wk龄出现内皮细胞脱落(Fig2E);而心尖小动脉在18wk以后只出现中膜增厚,无内皮脱落(Fig2F)。卡托普利18～24wk能抑制SHR胸主动脉中膜增厚,减少内皮细胞脱落,停药后中膜厚度回到SHR空白水平,内皮细胞层与中膜间隙增大,但未脱落(Fig2G)。说明卡托普利能抑制胸主动脉中膜增厚,减少内皮细胞脱落,改善内皮功能。肠系膜上动脉和心尖小动脉中膜厚度在18和24wk时均无减小,反而出现内皮细胞脱落增加(Fig2H,I),说明卡托普利不能改善肠系膜上动脉和心尖小动脉的内皮功能。比较上述三类血管的病理学切片可知,WKY在32wk胸主动脉出现内皮脱落,但肠系膜上动脉和心尖小动脉血管形态基本无变化;SHR在18wk各动脉均出现一定病变,大血管病变程度高于中、小动脉。卡托普利可抑制胸主动脉内皮脱落和中膜增厚,但对肠系膜上动脉和心尖小动脉无此作用。2.3ach浓度依赖血管舒张反应2.3.1拉伸温度fig3WKY肠系膜上动脉6～32wk期间舒张度没有明显变化(Fig3A);胸主动脉32wk舒张度减小(Fig3B),推测是年龄引起的血管功能退化。2.3.2肠系膜上动脉参数变化SHR-6wk的肠系膜上动脉和胸主动脉内皮舒张功能均完好(Fig4A)。跟SHR-6wk相比,肠系膜上动脉18wk舒张度降低(Fig4B),24～32wk进一步降低,显示年龄越大舒张度越低的趋势,但24wk后稳定。胸主动脉随年龄增大舒张度变化趋势与肠系膜上动脉相似,但降低幅度大于肠系膜上动脉(除18wk外,P=0.10)。说明同周龄SHR胸主动脉的内皮损伤程度比肠系膜上动脉严重。2.3.3知识产权法上动脉的张力卡托普利组肠系膜上动脉18～32wk舒张度跟SHR空白组比较差异无显著性(Fig5A、Fig6A、Fig7A);说明卡托普利并不能改善SHR肠系膜上动脉的内皮功能;18wk时胸主动脉的舒张度跟SHR空白组比较增大(Fig5B),24wk和32wk时差异无显著性(Fig6B、Fig7B)。说明给予卡托普利在SHR发病早期能改善胸主动脉舒张功能。3血管内皮功能异常长期以来血管内皮细胞只被认为是一个屏障组织,近30年来,内皮细胞参与血管调节的作用逐渐被认识。大量的实验证明,内皮细胞功能正常与否直接关系到血管功能及血管内环境的稳定。它通过分泌一些内皮依赖性因子维持血管中收缩和舒张、血凝和抗凝、氧化和抗氧化、炎症和抗炎等的平衡。内皮功能主要受一氧化氮信号系统、肾素血管紧张素醛固酮系统调节,血管内皮细胞长期功能不全将严重影响一氧化氮生物利用度,进而导致包括高血压、动脉粥样硬化、充血性心力衰竭、糖尿病、肾脏疾病以及脑血管疾病等,内皮功能的恢复和保护有望成为有效防治心脑血管疾病的新的策略。本实验以SHR大鼠为模型研究高血压发展进程中,不同血管内皮细胞病变程度及其抗高血压药物对其的干预。已有实验发现,SHR从5wk龄开始血压持续上升,20wk龄后血压值稳定。胸主动脉从10wk龄开始发生病变,表现为内皮细胞排列紊乱甚至脱失,内膜面粗糙不平,中膜增厚。血管的这种病变又会导致血压的升高,引发恶性循环。SHR20wk后血压开始稳定,但血管的病变并没有停止,反而更加严重。以上均表明内皮功能不全参与了遗传性高血压的发病,并是使高血压发展的促发因素。本实验从18wk开始比较各组血管病变差异,除对SHR胸主动脉形态变化观察以外,还考察了肠系膜上动脉和心尖小动脉的形态变化并相互比较。发现SHR胸主动脉、肠系膜上动脉和心尖小动脉都存在形态结构损伤,但同周龄大鼠胸主动脉病变程度明显高于后两者;卡托普利干预能抑制胸主动脉形态病变,但不能改善肠系膜上动脉和小动脉病变。动脉可分为大动脉、中动脉、小动脉和微动脉,不同动脉形态结构和其生理功能均不同,在高血压病发过程中,不同动脉抗损伤能力不同,对药物的反应亦不同。该实验发现随着年龄增大SHR胸主动脉肠系膜上动脉舒张功能均受损,且胸主动脉损伤程度显著大于肠系膜上动脉,呈现大动脉较中、小动脉更容易发生病变的趋势。进一步的卡托普利干预SHR损伤血管修复的实验显示,损伤程度深的大动脉ACh依赖性舒张功能可通过用药来修复,而不容易受损的中动脉一旦发生损伤,用药不能修复其Ach依赖性舒张功能。该趋势原因是否