高原地区-亚麻酸发酵条件的优化

高原地区-亚麻酸发酵条件的优化

它通常是一种含有大量脂肪酸的药物，如豆状激素（goa）。它对糖尿病、皮肤红斑和心血管疾病的治疗都有一定疗效。因此，经常使用口服营养成分的药物。GLA过去多从月见草籽中提取,这易受种植等因素的限制。微生物发酵生产GLA具有生长速度快、培养简单且原料不受限制等特点,所以越来越受到人们的重视。目前国内多采用被孢霉(Mortierella)发酵生产GLA,我们以雅致枝霉为出发菌株,对其进行了诱变育种,获得高产GLA的诱变株TE7-15。本文对其发酵条件进行了研究,旨在开发生产GLA的新的微生物资源。1材料和方法1.1新型培养基雅致枝霉(Thamnidiumelegans)AS3.3456,中国科学院微生物研究所国家菌种保藏中心;雅致枝霉TE7-15突变株是AS3.3456菌株经5-氟尿嘧啶、紫外线和氯化锂复合诱变选育而得。斜面培养基:霉菌培养基,北京市海淀区微生物培养基制品厂;种子培养基(g/L):葡萄糖30,酵母粉1.0,蛋白胨1.0,麦芽汁1.0,KH2PO42.0,柠檬酸钠0.5,CuSO40.5×10-3,ZnSO47.5×10-3,MnSO42.0×10-3,pH6.0;基础发酵培养基(g/L):葡萄糖50,酵母粉1.0,蛋白胨5.0,KH2PO42.0,CaCO30.3,MgSO40.3,CuSO40.5×10-3,ZnSO47.5×10-3,MnSO42.0×10-3,柠檬酸钠2.0,pH6.0。1.2培养三角封装液菌种在斜面培养基上于15℃培养5d,活化。将活化后的菌种接种于种子培养基,以100ml的三角瓶装液10ml,在15℃下,120r/min培养24h。在装有培养基100ml的500ml三角瓶接入种子液,接种量10%,15℃,140r/min培养5d。发酵液经的确良布过滤,蒸馏水洗涤后,称湿重,取部分湿菌体,100℃烘干至恒重,冷却后称干重,以确定菌体得率。1.3分析1.3.1用信息共同加入甲醇过滤法注1湿菌体按每克菌加4mol/LHCl6ml混匀,室温放置1h,于沸水浴煮沸3min,置于冰室速冷,然后加入氯仿及甲醇(1∶1),混匀后离心,挥发除去氯仿即得油脂。1.3.2油中脂肪酸的相色谱分析1.3.2.气相色谱分析油脂加入皂化液(0.5mol/LKOH-甲醇)2ml,混匀,于60℃水浴皂化至油珠消失,冷却后加入甲酯化液(14%三氟化硼-甲醇)2ml,于60℃水浴甲酯化30min,冷却后加入正己烷1ml,饱和氯化钠1ml,离心后取上清液,即可用于气相色谱分析。1.3.2.2.规范以高纯度的GLA甲酯(Sigma产品,纯度99%)作为标准品。1.3.2.检测柱及设备用PE-XL气相色谱仪分析油脂组成;FAMEWAX石英毛细管色谱柱,柱长30m,内径0.32mm,液膜厚0.35μm。检测器为氢火焰离子化检测器(FID)。程序升温条件为:柱温190℃时,以0.3℃/min升至191℃,再以4℃/min升至225℃,维持15min。2结果2.1淀粉和蔗糖对菌体生长和油脂积累的影响在培养基中加入不同碳源进行对比实验(表1),结果表明,可溶性淀粉和蔗糖均不利于菌体生长及油脂积累;蔗糖有利于GLA的合成,但GLA是胞内脂肪酸,我们不能以GLA含量作为唯一指标,必须同时考察菌体干重及油脂产率,因此只有葡萄糖对各项指标可以兼顾。2.2gla合成资源的影响本实验以葡萄糖为碳源,采用不同氮源进行比较实验,结果(表2)表明,利用尿素作氮源虽然有利于菌体生长,但不利于油脂的积累;(NH4)2SO4有利于促进GLA的合成,但不利于菌体生长;而KNO3、蛋白胨对菌体生长及GLA产量的影响相近,对各项指标均可兼顾,但蛋白胨成本较高,所以我们选择KNO3作为氮源。2.3不同温度下对细菌生长和gla产量的影响我们采用不同温度进行培养,结果(表3)表明,该菌株要求适当的低温环境,12℃既有利于菌体生长,也有利于积累油脂并合成GLA。2.4gla合成培养时间由表4可以看出,随培养时间的延长,菌体生长、油脂积累都逐渐增多,超过184h油脂积累虽然仍在增多,但菌体生长逐渐减慢,且GLA合成比例逐渐下降即GLA合成的增加量与培养时间不成正比,继续延长时间则油脂积累也减少,所以综合评价后,我们选择培养时间为10d。2.5培养基和培养条件在上述实验基础上,我们又进行了葡萄糖浓度的选择、碳/氮比值的选择,最终确立的培养基组分为(g/L):葡萄糖100,酵母粉1.0,蛋白胨1.0,KNO35.0,KH2PO42.0,CaCO30.3,MgSO40.3,CuSO40.5×10-3,ZnSO47.5×10-3,MnSO42.0×10-3,柠檬酸钠2.0,pH6.0。培养温度为12℃,培养时间为10d。以此条件进行摇瓶发酵实验,结果见表5。3gla含量的变化本研究对雅致枝霉诱变株TE7-15进行了优化培养,调整了碳源、氮源等指标,初步确立了发酵培养条件。发酵实验结果表明:每升培养物菌体干重为19.04g,油脂含量为2.25g,GLA含量占总脂的27.41%,即每升发酵液产GLA1.08g,已达到工业化生产的指标,为GLA的发酵生产提供了新的菌株。目前国内利用微生物发酵生产GLA的