调肝健脾补肾方药及人参总皂甙对反复心理应激大鼠中枢h的影响

调肝健脾补肾方药及人参总皂甙对反复心理应激大鼠中枢h的影响

氨基酸羟基酶（th）是促进酪氨酸（tyr）合成胺（da）、脱甲基硝胺（ne）和酪氨酸（e）的催化剂，它可以提高和抑制th的活力，并对caiocontamca的合成产生重大影响。TH作为CA合成的限速酶在应激反应中具有重要的作用。本实验采用反复制动限制活动空间的方法制成心理应激大鼠模型,在此基础上观察了应激大鼠下丘脑TH和下丘脑及海马Tyr含量的变化以及调肝、健脾、补肾方药及人参总皂甙对其的影响,现将结果报道如下。1材料和方法1.1不同类型中药的刺激Wistar大鼠,雌雄各半,体重180～220g,正常饮食,在光一暗周期为12h,温度为(20±2)℃的安静环境下饲养7d。按体重随机分为6组:正常组(normalgroup),不施加任何刺激;模型组(modelgroup),给予制动刺激,不予中药;调肝组(liver-regulatingherbgroup),制动刺激前给予调肝方药;健脾组(spleen-strengtheningherbgroup),制动刺激前给予四君子汤;补肾组(kidney-tonifyingherbgroup),制动刺激前给予肾气丸;人参总皂甙组(ginsenosidegroup),制动刺激前给予人参总皂甙。1.2药材、药品、制剂:四君子汤、人参皂茯苓液的制备组采用鸡病调肝方药组成及剂量:柴胡5g、白芍15g、枳壳6g、枸杞子15g、山栀子5g、干地黄18g、石决明30g。肾气丸组成及剂量:干地黄30g、山药15g、山茱萸15g、泽泻10g、茯苓10g、丹皮10g、桂枝4g、附子4g。四君子汤组成及剂量:党参20g、白术15g、茯苓15g、炙甘草6g。药材由本校第一附属医院药房提供,经药剂科鉴定均为纯正药材,常规煎煮取汁后,调肝方药浓缩至含生药1.69g/mL,四君子汤浓缩至含生药1.01g/mL,肾气丸浓缩至含生药1.76g/mL(用药剂量为成年人70kg体重剂量的10倍)。高压灭菌,4℃冰箱保存备用。人参总皂甙由长春白求恩医科大学药剂科提供,配制成水溶液7mg/mL。调肝组、补肾组、健脾组及人参总皂甙组均于制动刺激前1h相应给予调肝方药、肾气丸、四君子汤及人参总皂甙溶液2mL灌胃,正常组及模型组以2mL生理盐水灌服。1.3大鼠制动期间禁水时间采用限制制动的方法建立慢性心理应激反应模型。将造模大鼠置于自制的限制制动筒内(由大鼠固定仪改制而成),通过移动插片而逐步缩小大鼠的活动空间,调节到其不产生强烈反抗的紧张程度,每日限制制动1次,每日开始时间及限制制动时间不同,第1天为4h,其后每次增加30～60min,连续14d。造模大鼠在制动期间禁食、禁水。造模结束后在动物清醒、安静状态下进行实验。1.4指标和方法的检测1.4.1th抗体检测一抗:羊抗鼠THGoatpolyclonalIgG(N-15,Cat#SC-2848,Lot-1060)购自Sigma公司,经预实验确定TH抗体血清稀释度为1:250～1:200。二抗:Donkeyanti-goat购自基因公司。ABC染色试剂盒购自基因公司;DAB显色剂购自武汉博士得公司;其他液体:40g/L多聚甲醛(0.01mol的PBS液配制,pH=7.4);0.9g/L生理盐水;30mg/mL戊巴比妥钠溶液;PBS液(pH=7.4);0.01mol枸橼酸钠等。1.4.2机图像分析方法上海江湾Ⅱ型大鼠脑立体定位仪;TABPlus计算机图像分析仪;美国惠普HP-1050型高效液相色谱仪,配HP-1050型四元梯度泵、自动进样器,HP-1046A型荧光检测器和HPLC-2D色谱工作站。1.4.3测试指标下丘脑TH免疫组织化学观察采用ABC法,DAB染色。下丘脑与海马Tyr含量检测采用OPA柱前衍生反相高效液相色谱法。1.5方法1.5.1超声波辅助提取大鼠称重,断头,迅速取全脑,于冰盘上分离下丘脑和海马,电子天平称重记录。将下丘脑和海马分别置于玻璃匀浆器内,加入3mL甲醇,冰浴内充分匀浆,用毛细吸管将提取液转移至25mL离心管中,用2mL甲醇再提取2次,合并3次提取液,总计约7～8mL。摇匀,置超声波上处理30min,10000r/min冷冻离心30min,将上清液转入20mL小瓶中。80℃水温水浴至甲醇蒸发至干,在瓶内加入5.0ml/LHCl,置超声波处理30min。在超声波处理过程中,小心摇动小瓶,使氨基酸成分溶出,将溶出物转入10mL离心管中,10000r/min冷冻离心30min,取上清液,用于氨基酸分析。1.5.2脑内定位仪定位大鼠戊巴比妥钠(55mg/kg)深度麻醉,剑突下剪开皮肤、肋骨,沿心尖刺入左心室,沿主动脉方向将灌流针头刺入主动脉,以止血钳固定心脏和灌流针,剪开右心耳,快速灌注37℃生理盐水250mL,直至流出的液体澄清无血为止。继之快速灌注4℃40g/L多聚甲醛250～300mL。直到大鼠肢体无刺激症状为止,每只大鼠利用江湾Ⅱ型脑立体定位仪定位,具体位置为:经耳中线距嘴侧5.8～5.6cm的经杏仁海马区冠状切面上。沿此冠状切面(肉眼:起始切片位置应该在视交叉后部)开颅取脑,将脑置入同样的40g/L多聚甲醛溶液中进行外固定48h。48h后,取出脑组织在室温下梯度酒精脱水,氯仿透明,石蜡包埋。切片厚4μm,隔5张连续留2张切片,使用序号做好标记,每只大鼠共计留20张片。每张载玻片留2张脑切片,左右各一。左侧为实验片(滴加一抗片),右侧为对照片(一抗以PBS代替,其余步骤均同)。每张切片作好标记。1.5.3血小板和牛毛,木素,苏.木常规石蜡切片,PBS液洗3次,每次5min。置切片于0.01mol枸橼酸钠(pH=6.0)中,微波炉内中档火95～100℃条件下烘干5min。取出后室温凉至40℃。PBS液洗2次,每次5min。每张切片滴加一滴封闭血清,室温下孵育20～30min。甩掉未结合的液体。实验侧每张切片滴加50μL或者1滴一抗,4℃过夜。对照侧切片滴加等量的PBS液。过夜后,PBS液冲洗3次,每次5min。每张切片滴加生物素标记的二抗,室温下孵育30～40min。PBS冲洗3次,每次5min。每张切片滴加1滴AB反应物溶液,室温下孵育40min。PBS洗3次,每次5min。加入过氧化物底物,孵育1～3min,镜下观察,蒸馏水冲洗,终止染色。苏木素复染,10～15s,慢速流水冲洗,自然风干,中性树脂胶封固。免疫组化空白对照实验:用PBS代替一抗孵育切片,结果阴性。1.5.4数麻黄th阳性细胞用于光镜观察的切片在10×20倍数下按Paxinos和Watson脑图谱,由吻—尾侧方向计数下丘脑TH阳性细胞。TH阳性细胞表现为细胞呈菱星状成簇分布,阳性纤维呈条带状,免疫反应产物为棕红色,染色均匀,分布于胞体和细胞突起。以见到胞核断面为有效计数,在显微镜下,用微尺测定细胞的最大直径,根据光密度值,经计算机图像分析仪数出强阳性细胞数(被计数的细胞有细胞核)。1.6统计处理所有结果以表示,采用SPSS统计软件进行方差分析和t检验。2结果2.1th阳性细胞的变化表1结果显示,模型组大鼠下丘脑弓状核、腹内侧核、背内侧核、室旁核以及室周核均有TH阳性细胞以及阳性纤维出现,尤以弓状核与下丘脑腹内侧核TH阳性细胞明显增多(P<0.01)。调肝方药可明显增加两核TH阳性细胞数(P<0.01),肾气丸对两核TH阳性细胞数量无明显影响,四君子汤和人参总皂甙有明显上调两核TH阳性细胞数量的作用(P<0.01)。2.2各组小鼠海马tyr比较表2结果显示,模型组下丘脑与海马Tyr无明显变化。与模型组相比,调肝组、健脾组与人参总皂甙组下丘脑Tyr明显下降(P<0.01);补肾组与健脾组海马Tyr水平则明显升高(P<0.01)。提示4组中药对于调节反复心理应激大鼠中枢Tyr机制具有相同之处。3不同中药对小鼠海马tyr、da在应激状态下,在下丘脑许多核团如室周核、弓状核和腹内侧核等区域有广泛的TH表达。TH存在于肾上腺素能、多巴胺能神经元和肾上腺髓质嗜铬细胞的胞浆内。各种应激均可以导致中枢TH表达增强,TH蛋白合成增多。本实验研究发现,在反复制动心理应激大鼠下丘脑弓状核、腹内侧核、背内侧核、室旁核以及室周核均有TH阳性细胞以及阳性纤维出现,尤其下丘脑弓状核和下丘脑腹内侧核的阳性细胞和阳性纤维数量明显超过正常组。可见,本实验的反复制动心理应激大鼠下丘脑弓状核和腹内侧核的TH细胞功能活动明显增强。结合下丘脑Tyr含量无明显改变,推测可能是Tyr含量丰富,相对于TH细胞增强的功能活动而言,并没有显得不足。应用中药对慢性心理应激反应进行调控的研究报道较少,心理应激反应的物质基础是神经内分泌免疫调节(neuroendocrine-immunomodulation,NIM)网络。尽管目前已有许多研究表明调肝、健脾、补肾方药以及人参总皂甙对NIM网络具有调节作用,但作用机理不尽相同,特别是从心理应激角度而言,不同方药的中枢作用机理尚不清楚。本研究发现,调肝、健脾方药及人参总皂甙均可明显增加下丘脑两核TH阳性细胞数,由此提示,上述方药可通过增强TH功能,进而增强机体应对应激的能力。而补肾方药似乎对下丘脑TH无显著影响,这有待进一步研究。此外,本次实验及以往研究发现,调肝方药可使应激大鼠下丘脑Tyr含量明显下降(P<0.01),对海马具有下降趋势的Tyr也具有一定的上调作用,与正常对照组相比无显著性差异。肾气丸对下丘脑Tyr具有下调趋势,但可明显提高海马Tyr水平,并超过正常对照组(P<0.01),其具体机制还有待于进一步探讨。四君子汤可明显降低下丘脑Tyr(P<0.01),升高海马Tyr水平(P<0.01)。人参总皂甙被广泛地应用于抗应激损伤,从中医理论角度而言,人参总皂甙重在培补元气,从而提高机体抗应激的能力。我们研究发现人参总皂甙可以明显降低下丘脑Tyr(P<0.01),对海