微量稀释法测定抗真菌剂对acc质控菌最低抑菌浓度

微量稀释法测定抗真菌剂对acc质控菌最低抑菌浓度

1997年，美国国家临床实验室（cnis）发布了关于抗真菌药物敏感试验的参考方法。然而,NCCLS方法由于操作较繁琐,难于在日常工作中推广。国外目前已有商品化试剂盒问世,但价格较昂贵。我们参考NCCLS方法有关要求,设计并研制了酵母菌药敏试验最低抑菌浓度(MICs)测定板,建立了微量稀释法抗真菌药敏试验方法,经比较评价和临床初步应用,效果满意,报告如下。1材料和方法1.1材料表面1.1.1菌株鉴定方法临床分离106株,其中Candidaalbicans(白色念珠菌)60株、Candidatropicalis(热带念珠菌)20株、Candidaparapsilosis(近平滑念珠菌)12株、Candidakrusei(克柔念珠菌)8株、Candidaglabrata(光滑球拟酵母菌)4株、Cryptococcusneoformans(新型隐球菌)2株。菌株鉴定采用API20CAUX鉴定系统。质控菌株:近平滑念珠菌ATCC22019、克柔念珠菌ATCC6258,由解放军总医院微生物科赠送。1.1.2氟康唑、两性霉素b伊曲康唑(Itraconazole)二级对照品(纯度99.7%)、酮康唑(Ketoconazole)二级对照品(纯度99.9%)由杨森公司惠赠;氟康唑(Fluconazole)由辉瑞公司提供,纯度99.7%;两性霉素B(AmphotericinB)标准品(855U/mg)由中国药品生物制品检定所生产;5-氟胞嘧啶(Fluorocytosine)购于Sigma公司,纯度99.7%。氟康唑和5-氟胞嘧啶以水为溶剂,贮藏液浓度1280μg/ml。酮康唑、伊曲康唑和两性霉素B以二甲亚砜为溶剂,贮藏液浓度1600μg/ml。贮藏液存于-20℃以下备用。1.1.3ph值的调优在RPMI1640培养基(含谷氨酰胺及酚红指示剂,不含碳酸氢钠)加入18g/L葡萄糖,以0.165mol/L吗啉丙烷磺酸(MOPS)为缓冲液调pH值到7.0。加热溶解过滤除菌后,再在此RPMI1640液体中加入高压灭菌已融化的琼脂溶液,使最终琼脂含量0.5g/L,无菌手续定量分装于灭菌容器以备微量稀释法测MIC用。1.2方法1.2.1氟康唑、伊曲康唑和两性霉素b浓度对氟康唑、伊曲康唑和两性霉素b浓度的影响在无菌净化台内将每种药物贮藏液进行倍比稀释成11个浓度(氟康唑和5-氟胞嘧啶浓度范围1.25~1280μg/ml,氟康唑、伊曲康唑和两性霉素B浓度范围0.15~160μg/ml)。以微量加样器从低浓度到高浓度依次将药液加入经消毒的8×12孔U型微量滴定板内,每孔10μ1,第12孔为无药空白对照,冰冻干燥后贴上不干胶纸密封,置于-20℃保存可稳定半年以上。1.2.2改造“鉴定”水文压将受试菌在沙保弱培养基上传代二次,挑取生长24h直径≥1mm念珠菌(隐球菌48h)菌落3~5个,悬浮于5ml8.5g/L无菌盐水中,调整其浊度达到0.5麦氏标准管(1×106~5×106CFU/ml)。用上述制备好的含0.5g/L琼脂和18g/L葡萄糖的RPMI1640培养基稀释2000倍至终浓度为5×102~2.5×103CFU/ml(沙保弱平板菌落计数证实),用于微量稀释法MIC测定。1.2.3mic终点判定将上述稀释好的接种物,以无菌手续加入制备好的MIC测定板中,每孔100μl。此时,氟康唑和5-氟胞嘧啶终浓度范围:0.125~128μg/ml,酮康唑、伊曲康唑和两性霉素B终浓度范围:0.015~16μg/ml。35℃,念珠菌孵育24h和48h、新型隐球菌孵育72h,观察结果。MIC终点判定,与对照孔按下列标准比较,0:肉眼观察清晰;1:轻度模糊;2:浊度显著减低(约50%被抑制);3:浊度轻度减低;4:浊度不减低。两性霉素B以肉眼观察清晰不混浊孔为MIC判定终点,其余4种药取2(浊度显著减低)为MIC判定终点。1.2.4参考方法按NCCLS推荐的常量肉汤稀释法进行。为使两法间MIC结果具可比性,浓度范围与微量稀释法相同。1.3准确性和重复性采用双盲法对每株受试菌进行微量稀释法和参考方法的配对测定,以参考法为标准,计算微量法24h和48h与参考法(48h)间结果在±1稀释度内符合率,来判定方法的准确性。用ATCC质控菌对微量稀释法进行重复试验,来判定方法的重复性。结果统计时,高于测定浓度范围上限(128和16μg/ml)的结果,统一记为>128μg/ml和>16μg/ml;低于和等于下限的结果,统一记为≤0.125μg/ml和≤0.015μg/ml。2结果2.1株新型隐球孵育4h和48h的mic测定结果比较微量稀释法测定5种抗真菌药物对106株受试菌MIC,共得530个MIC数据。其中对念珠菌孵育24h和48h测得MIC结果与参考方法(48h)比较,在±1稀释度范围内总符合率分别为75.6%和93.2%。2株新型隐球菌孵育48h测定MIC均低于参考方法结果1个稀释度,72h测定结果与参考法相同。2种方法测定5种抗真菌剂对104株念球菌MICs结果在±1稀释度范围内符合率见表1。2.2质控妇人mic检测结果用微量稀释法测定5种抗真菌药物对2株ATCC质控菌的MIC(48h),各测50次,以质控中位数为标准与测定结果比较,则测定结果在质控中位数±1稀释度范围内总符合率为95.8%,见表2。3菌株鉴定结果由于酵母样真菌引起的全身性感染率增加和对抗真菌药物耐药性的出现,在常规工作中开展真菌药敏试验十分必要。NCCLS虽已推荐了参考方法,但由于其费时、费力且操作繁琐,不适于日常工作。我们将5种抗真菌药直接固化于微孔板,自制了MIC测定板,免去了参考方法每次测定需配试剂的繁琐手续,解决了酵母菌微量稀释法药敏试验简便性问题。在RPMI1640培养基中加入18g/L葡萄糖,促进菌株的生长,利于观察结果,加入0.5g/L琼脂,使酵母菌在培养基中均匀分布,判断结果时不需振摇而便于结果观察。本研究结果表明,微量稀释法测定抗真菌剂对常见念珠菌MIC,其48h测定结果与NCCLS推荐的