十字花科植物不同器官的过氧化物酶、-淀粉酶和苯丙氨酸解氨酶活性分析

十字花科植物不同器官的过氧化物酶、-淀粉酶和苯丙氨酸解氨酶活性分析

花卉科的许多植物具有很高的营养价值和药用价值，通常用作食物和药物。研究显示,有些十字花科植物具有显著的抗癌作用。过氧化物酶[peroxidase,POD,EC1.11.1.7],能有效地清除生物体内的过氧化物,是生物抗氧化保护系统的主要成分之一;苯丙氨酸解氨酶(phenylalanineammonia-lyase,PAL,EC4.3.1.5)是连接初级代谢和苯丙烷类代谢的关键酶和限速酶,药用十字花科植物的许多药用成分都由苯丙烷类代谢途径产生;POD是一种多底物的酶,除过氧化氢作为其必须底物外,苯丙烷类代谢途径所产生的许多产物也是POD的底物,POD,PAL在植物次生代谢中起重要作用。α-淀粉酶(α-1,4-glucan-4-glucanohydrolase,EC3.2.1.1)所产生的葡萄糖可为PAL和POD的代谢提供直接的或间接的碳骨架和氢供体。本研究选用开花时间都比较接近,且既可以食用又可以药用的3种十字花科植物荠菜[Capsellabursa-pastoris(L.)Medic]、独行菜(LepidiumapetalumWilld)和播娘蒿(Descurainiasophia(L.)Webb)作为材料,比较了在正常生理环境下3种植物花期不同器官的PAL,POD,α-淀粉酶的活性和可溶性蛋白、H2O2的含量,旨在探讨它们之间的相互作用及其与药用成分之间的关系,为提高十字花科植物的营养价值和药用价值提供新的依据。1材料和方法1.1材料表面十字花科植物荠菜、独行菜、播娘蒿,分别于2004～2006年4月16～26日采自河南师范大学生物园。1.2方法1.2.1pal和pod的测定分别取植物的根、茎、叶、花,清洗干净后,用滤纸蘸干,称取2g,加适量的石英砂在冰浴下充分研磨,然后按M∶V=1∶1(根为1∶2)加入样品缓冲液,其中POD的样品缓冲液为pH7.0,50mmol/L磷酸缓冲液;α-淀粉酶为pH5.0,10mmol/L醋酸缓冲液;PAL为pH8.8,5mmol/L巯基乙醇,0.1mol/L硼酸缓冲液;H2O2样品则在加入0.5mL蒸馏水和3mL丙酮匀浆后,加入同体积的萃取液V(CCl4)∶V(CHCl3)=3∶1进行萃取脱色;所有的样品在匀浆后,10000r/min,4℃离心10～20min,离心后取上清直接测定或储藏于-20℃备用。POD的活性测定采用愈创木酚法,以单位鲜重的每分钟光吸收度的变化值为酶活力,即△OD470nm/(min·g)表示;采用Bradford比色法于595nm处测定可溶性蛋白含量,以小牛血清蛋白作标准曲线;用β-极限糊精法测定α-淀粉酶活性,测定波长为560nm,酶活单位为:μg/(h·g);PAL的活性测定采用巯基乙醇法,酶活单位为:ΔOD290nm/(h·g);H2O2含量的测定用硫酸钛法,测定波长为410nm,以其消光系数ξ=0.28L/(mol·cm)计算其含量,单位为mmol/g。1.2.2酶同工酶电泳采用垂直板聚丙烯酰胺不连续凝胶电泳方法,电泳完后参照胡能书的方法,POD用联苯胺染色,α-淀粉酶用稀碘液显色。2结果与分析2.13-淀粉酶活性由表1可以看出,所测的POD活性在3种植物中虽有差异,但变化趋势相同,根的POD活性都比较高,其次是茎、花、叶,由于在试验期,独行菜花的采集较为困难而缺失花的数据。α-淀粉酶在荠菜的花、播娘蒿叶和花、独行菜的根中有较高的活性,且独行菜各器官中α-淀粉酶活性较其他2种植物都高;荠菜根PAL活性明显比其他2种植物要高,而荠菜和播娘蒿茎的PAL活性也相对较高,在播娘蒿和独行菜叶中不能检测到PAL活性。2.23播关于在菜中的可溶性蛋白表2中可溶性蛋白含量在荠菜各器官中表现为根<茎<叶<花,在独行菜中趋势也类似,播娘蒿各器官中可溶性蛋白含量极高,其中根和花器官中尤其明显。在荠菜叶和播娘蒿花中H2O2含量较高,而它们根中由于H2O2含量太低而无法检测到。2.33不同枝、叶、花、根、茎、叶从图1Ⅰ、Ⅱ可以看出,不同植物不同器官POD、α-淀粉酶同工酶谱条带不同,如Ⅰ中荠菜根有3条主带,茎有4条主带,花有4条主带,其中根、茎、花有3条共有酶带;独行菜根、茎、叶有3条共有酶带,其分别有6,3,4条主带;播娘蒿根、茎有3条主带,叶、花有2条主带,它们有2条共有条带;Ⅱ中荠菜根、茎、叶、花中有2～4条主带,有2条共有条带;独行菜中只有1条主带;播娘蒿的茎、叶、花器官有共有条带,而根有其独特条带。显示了其组织特异性和种间差异。3pod与播婆蒿、自由生长的同工酶谱带十字花科植物全世界约375属,3200种,我国有95属约400种,其中大多数是重要的经济作物和药用植物。本试验首次探索了3种既可食用又可药用的十字花科植物,花期的根、茎、叶、花4种器官的POD,PAL,α-淀粉酶等生化指标。试验结果表明:3种植物的不同器官中均有较高的POD活性,尤其是根和茎中的POD活性较高,3种植物中又以荠菜根的POD活性最高。由于POD是一类重要的氧化还原酶类,参与植物许多生长发育过程。根中较高的POD活性是由于根部与土壤环境的接触最为直接和密切,其主要功能是吸收养分和贮存物质以及抵御外界伤害性刺激,较高的POD活性可以对抗因环境改变造成的植物体内的活性氧上升,对植物起到保护作用。而且POD催化木质素生物合成中最后一步反应,根和茎部木质化程度较高,较高的POD活性与其功能相适应。POD也参与叶绿素的降解,因此叶中的POD活性较低。同工酶谱常被用于种质资源和遗传进化的研究,POD同工酶谱已用于多种十字花科植物如大白菜、油菜、诸葛菜、蓝花子等的分类及品种鉴定,相同的品种有相同的同工酶谱带。本试验所研究的3种植物也具有相同的POD同工酶谱带(Rf=0.35),但是,荠菜的POD同工酶谱带以较大的核质比谱带为主,而独行菜和播娘蒿的同工酶谱带则主要为核质比较小的条带。后两者的种子是中药葶苈子,其主要成分是由芥子酸和胆碱生成的酯类物质芥子碱(sinapine)。芥子碱是一种非常有价值的天然抗氧化剂,在抗衰老药物的研究中具有重要意义。由此可见,POD同工酶谱不仅可以作为分类依据,也可以研究植物的功用,具有相同药理作用的植物可以有类似的同工酶谱。本试验结果表明,PAL在3种植物中除了在荠菜根部的活性最高外,茎中活性较高,由于PAL与细胞分化也有很大关系,而PAL催化的苯丙烷类代谢中生成的肉硅酸等中间产物又可进一步转化为木质素、香豆素、阿魏酸、绿原酸、类黄酮、生物碱等次生代谢产物,其中阿魏酸、芥子酸等中间产物,具有重要的药用价值:阿魏酸能治疗多种心脑血管疾病;Rubery和Notheote在多种植物中发现在木质化组织中含有较高的PAL活性,木质素含量与PAL,POD活性成正相关。茎的主要功能是在根和叶等组织间运输物质,且随着植物的不断生长,其木质化速度也随之加快,故其PAL活性较高。由于PAL参与的苯丙烷类代谢途径所产生的许多药用成分如香豆素、阿魏酸等也是POD的底物。本试验证明,独行菜和播娘蒿的根中的POD活性较高而茎中PAL活性较高,从而有利于植物的药用成分积累。播娘蒿、独行菜的特征性成分黄酮类,具有抗氧化、抗癌及抗微生物和除臭的功能,与该两种植物止血、消炎的功效有关。晁志等研究发现,益母草中生物碱成分对大鼠有利尿作用。本试验供试植物荠菜、独行菜和播娘蒿中的胆碱、乙酰胆碱等都属于该成分,由此推测这3种植物的清热利尿之效可能与其中的生物碱成分有关。本试验结果表明,POD和PAL活性高的器官其H2O2含量则低,由于H2O2是一种活性氧,它可以生成极具破坏性的OH,OH可启动连续性的脂质过氧化作用,不仅只是细胞代谢中有害的副产品,它同时对植物抗病基因的表达和局部细胞的凋亡具有重要的调控作用,且H2O2是POD的特异性底物,PAL也是植物体内的一种重要的抗性酶,在植物的生长发育过程和抗病虫中起着非常重要的作用,其产物阿魏酸对活性氧如OH,O−⋅2Ο2-⋅和H2O2有较强的清除能力。另外苯丙烷类代谢的大量产物直接或间接地为POD提供了氢供体,如POD参与阿魏酸等酚类化合物的氧化。荠菜的POD和PAL含量在根、茎、叶、花器官中较高,从而证实了荠菜全株入药的正确性。本试验结果显示,可溶性蛋白在叶和花中含量较高,是由于叶是光合器官,虽然叶中可溶性蛋白含量较高,但其光合酶系统占主要成分,使得其他酶含量较低。花是植物的生殖器官,是在花期代谢最旺盛的器官。不仅其可溶性蛋白含量高而且淀粉酶活性也高,为其提供了物质基础。这也是花具有较高营养价值的原因。根和茎部也含有较高的α-淀粉酶活性,可使其贮存的淀粉迅速分解,从而为植株的生长发育和其他物质的合成提供能量和碳骨架,糖的分解也为POD提供氢供体。而叶相对较低的淀粉酶活性使得叶有利于将新合成的单糖或寡糖转运到其他器官。本试验结果显示独行菜和播娘蒿具有较高的淀粉酶活性和相对集中的同工酶谱带,而