国外生物制品质量标准2010年药典会-

国外生物制品检验方法研究进展

王军志中国药品生物制品检定所提纲一.国际交流促进了质量标准研究与发展二.高端理化方法用于生物制品质量研究三.新生物学活性测定方法的研究四.热源检测替代方法研究

一.国际交流促进了质量标准研究与发展WHO英国NIBSC德国PEI加拿大CBR美国USP测量学（Metrology）：

测量结论基础:方法验证（Validation）追溯（Traceablity）不确定性（Uncertainty）随着测量技术进步，新的分析测量手段应用于生物测量中，如:芯片技术开发在基因水平对测序的评价方法。关于标准溯源（TraceablityChain）：国际标准（SI）NMI药典（Pharmacopoeias）协作标定实验室（CalibrationLabs）常规测定实验室（RoutineMeasurementLabs）

Bio-measurements主要含义：

1.采用生物学方法进行测量包括生物测定（Bioassays）、动物水平,细胞水平,分子水平的定量测定等。2.对生物制品本身结构特性的测定，如圆二色分析蛋白质、分子结合物表面共振分析等。对于复杂的蛋白分子，理化测定方法虽然可以提供比较多的结构信息，但其不能完全反映蛋白质的高级结构。虽然生物学活性的测定值可信限范围比较大，但其作为特异的定量方法仍被广泛应用。只有在理化结构的测定比较全面彻底，并且理化测定方法与生物学活性测定方法关系明确，同时生产工艺稳定时，理化方法才可以替代生物学活性测定方法。近年来随着新技术、新产品的出现，而使生物测量的含义不断得到充实和扩展：基因递送体系的发展（基因治疗）细胞治疗的发展（干细胞治疗）生物相似性概念的发展NIBSC在生物测量中有三个比较突出的进展：免疫反应定量检测方法将蛋白质组学技术用于疫苗的质量分析生物测定终点法的合理发展（“Rationaldevelopmentofbioassayend-points.”）英国NIBSC重点研究方向：针对基因治疗载体的分析方法研究干细胞分化状态下，抗原表达分析治疗用糖蛋白生物活性与糖基化相关性研究细胞因子治疗病人的抗体分析标准方法采用定量、伦理方式改善及替代测定方法以毒素效价为基础的毒性评价方法

NIBSC将蛋白组学在疫苗质量控制中的应用：以MeningococcalOMVvaccine为例，采用I-DSDS电泳法，可以得到29条区带，采用质谱分析出40种蛋白多肽的序列。其中证明7种为关键抗原成份。采用二维电泳法（2D）发现152斑点，采用MS/MS法分离出74个多肽位段可以代表41个不同基因的产物。采用2D法分析两个企业同类产品，斑点数有显著差异。免疫蛋白组学可以通过分析混合蛋白，研究哪些是有用，哪些是无用的，从而确定抗原保护成份。Example:ComplexityofvaccinesProteomics-basedidentificationofantigenically-activecomponentspresentinOMVVaccinesagainstMeningococcalgroupBdiseaseIstheconceptofa“biological”(notcharacterisablebyphysico-chemicalmeansalone)stillvalid?生物测定终点法以细胞早期分子变化测定为基础：VEGF的生物学测定采用细胞内信号变化进行。q-PCR检测mRNA表达水平。通过IL-8mRNA诱导的VEGF活性测量。通常采用抗病毒检测法测定β-干扰素活性需要3天，而q-PCR法8小时就可以达到目的。RNA可直接通过细胞裂解物测定，不需要纯化或酶处理。生物测定终点法的发展（Bioassayend-pointdevelopment）：q-PCR方法可直接测定细胞早期的成份变化，可减少差异，改善灵敏度。内源性mRNA的测定不需稳定感染细胞的传代，并作为基因检测的报告实例。该技术可用于检测参考品和治疗产品效价，还可用于对更复杂材料（如血清）的诊断测定（中和抗体）。提高生物测定速度，如q-PCR法与传统理化测定技术共用，可以在线监测产品质量。出访情况简介访问时间：2009年5月3～7日地点：渥太华，加拿大卫生部生物制品质量研究中心（CenterforBiologicsResearch,CBR）人员:王军志叶强李长贵内容：参加“中加生物制品质量控制研讨会”并访问CBR参观CBR实验室与批签发部门的交流疫苗批签发由生物制品评价中心的实验室承担批签发实行分级管理，根据生物制品的种类、风险性进行评估，将其分为四个等级，如新疫苗和活疫苗为最高等级，除资料审核外，还需进行关键项目的实验室检测，最低等级的制品只进行资料审核。分级管理是动态的对CBR研究特色的体会生物/化学/分离方法的有机结合对生物制品结构和功能的相关性研究以各种高技术分析方法对生物制品质量进行深入研究新检测方法的研究新颖性、实用性对生物制品前沿领域的把握二.高端理化方法用于生物制品

质量研究1.生物/化学/分离方法结合分析糖蛋白单克隆抗体在不同供氧浓度时，采用HPAEC-PAD（高pH阴离子交换色谱和脉冲电流检测仪）

分析方法可以看到不同条件下的单抗的结构差异1.生物/化学/分离方法结合分析制品质量单克隆抗体在不同供氧浓度时，采用FACE（荧光辅助糖电泳

）质谱分析方法可以看到不同条件下的单抗的结构差异FACE分析MALDI-QqTOF-MS分析2.流感疫苗质量分析应用NanoLC/MS方法分析同一企业三批流感疫苗的质量红蓝绿代表三批制品2.流感疫苗质量分析应用NanoLC/MS方法分析三个企业流感疫苗的质量3.EPO糖基化分析EPO-αEPO-β不同企业的EPO通过毛细管电泳发现有不同的糖基化形态.成品分析，能在高浓度保护剂存在时分析3.EPO糖基化分析Migr.TimePeakArea%Mfr.Spec.Glycoform1unresolved

<5Glycoform2(+1) 16.15 33564 16.0 5-25Glycoform316.40 63537 30.3 20-35Glycoform416.67 65718 31.3 25-40Glycoform5(+6)16.97 46855 22.4 15-35Glycoform6unresolved

<84.NMR分析蛋白结构====NMR分析GM-CSF结构NMR分析rIFN-a2a结构正确折叠图谱非正确折叠图谱

三,新生物学活性测定方法的研究

国外已上市HPV疫苗

名称GardasilCervarix生产商MerckGSK包括病毒型别6、11、16、1816、18表达系统酿酒酵母杆状病毒表达系统佐剂非晶型羟基磷酸铝硫酸盐AS04(氢氧化铝＋MPL)免疫程序0、2、6月0、1、6月适应人群9～26岁的女性，9～15岁的男性（部分国家）10～25岁的女性批准现状美国、欧盟、加拿大、墨西哥等国家上市，其中在欧盟批准用于9～15岁男童欧盟、澳大利亚上市，美国已提交申请，尚未批准两种疫苗效力检测方法的比较(国外)GardasilCervarix4块微孔板2块微孔板每块反应板包括参考品待测样品参考品内质控待测样品封闭液PBS+1%BSA+0.05%Tween201%CaseininPBS稀释样品使用稀释板稀释样品，然后在反应板中每孔加入50µl已稀释样品直接在反应板中稀释样品解离液反应板中每孔加入50µl解离液不需要解离液孵育条件25ºC过夜，振摇37ºC过夜，振摇2小时效力检测方法的比较(国内)GSKHPV疫苗MerckHPV疫苗YSTHPV疫苗体内法体外法体内法

样品稀释后免疫小鼠使用ELISA检测血清中的抗体滴度.16,18

使用ELISA法检测疫苗中的抗原含量16,18,6,11样品稀释后免疫小鼠

使用Elispot检测血清中的抗体ED5016,18实验室操作培训：体外相对效力检测方法

(IVRP)参加人员分为三组，每两人配合完成试验按照NIBSC修订的SOP进行操作数据分析使用CombiStats对数据进行统计学分析该软件由EuropeanDirectoratefortheQualityofMedicines&HealthCare(EDQM)研发免费测试版：http://combistats.edqm.eu/site/combistats-635.htmlMerck方法.NIBSC认可3.干扰素效价测定新方法1）传统抗病毒试验的缺点：时间长（＞4天）；变异系数CV值高（达50%）；每次试验须对病毒进行滴定；2)以前研究报道过的方法特点：细胞系不太稳定（15代）；检测范围窄；3）新近研究报道的方法特点：更加简便、快速及较小变异。方法步骤将干扰素激活反应元件（theInterferonStimulationResponseElement，ISRE）插入人细胞系HEK293的染色体中.ISRE:干扰素受体,报告基因荧光素酶和嘌呤耐药基因复制细胞，筛选出最佳的细胞系进行干扰素效价测定验证试验干扰素效价测定试验：简便&良好稳定性

步骤1 步骤2 将CBR细胞与IFN同时加入培养板后进行培养

溶解细胞&读数CBR&McGill：按设计将干扰素反应元件(interferonresponseelement)整合入染色体中的细胞仅两步：将细胞与IFN同时加入培养板中，18hr后，溶解细胞加入荧光素酶底物,直接进行读数3.新检测方法的研究

－γIFN活性新方法将IFN刺激应答组件插入到人传代细胞中，并携带报告基因，筛选高拷贝插入序列和传代稳定的细胞株，用于IFN活性检测检测时间缩短为1天，重复性、变异性好，操作简单干扰素效价测定试验的特点细胞具有良好稳定性，传至52代后无差异

1)P=0.3426,>>0.05(对3个不同代进行比较)2)CV=5.02%(好于预期可接受的20-30%的范围)基质（4批）

1)P=0.08or>0.05

2)CV=11.88%(好于20-30%)操作人（3个）

1)CV=9-11.43%(in