蛋白质生化技术

蛋白质生化技术南开大学生命科学学院ProteinBiochemistryLabNankaiUniversity叶丽虹SELDI蛋白指纹技术GSTPull-Down报告基因系统PTDs蛋白质芯片-飞行质谱系统及其

在分子生物学中的应用背景介绍

蛋白指纹质谱技术（SELDI，SurfaceEnhancedLaserDesorption/Ionization，表面增强激光解吸技术）是2002年诺贝尔化学奖的核心技术，具有快速、简单和灵敏等优点,它不仅可在肿瘤诊断中用于发现标志物、观察治疗效果,还可用于研究蛋白质的修饰、相互作用、信号传导和酶促调节等,从而实现在蛋白质水平的大规模功能研究。传统蛋白组学研究（2D-MS）的局限性由于外加电场下的PH梯度不稳定，重复性差加样量小，分离的蛋白质很难鉴定可分析的蛋白质最多约1500种，难以检出蛋白质中占很大比例的低丰度蛋白质对于分离跨膜蛋白仍是技术难点电泳胶上的蛋白质斑点很大部分包含一种以上蛋白，以依次鉴定单个蛋白斑点为基础，限制了检测通量消耗时间长，一次电泳要5小时以上对技术水平要求高，不能完全自动化染色转移等环节操作技术条件要求高，耗时，不适应于大规模筛查和临床检测SELDI技术的优势直接用粗生物样品（血清、尿、体液）进行分析同时快速发现多个生物标记物微量样品(asfewas2000cellsforLCMsamples)高通量的验证能力（with1000sofsamplesamonth）发现低丰度蛋白质测定疏水蛋白质:与“双相电泳加飞行质谱”相比，除了有相似功能外，并可增加测定疏水蛋白质在同一系统中集发现和检测为一体特异性高：利用单克隆抗体芯片，可鉴定未知抗原/蛋白质，以减少测定蛋白质序列的工作量可以定量：利用单克隆抗体芯片，由于结合至芯片上的抗体是定量的，故可以测定抗原量，但一般飞行质谱不用于定量分析功能广：

I.利用单克隆抗体芯片,可替代WesternBlotII.利用单克隆抗体芯片,可互补流式细胞仪不足的功能，如将细胞溶解，可测定细胞内的抗原,而且灵敏度远高于流式细胞仪系统介绍

SELDI技术的蛋白质芯片－飞行时间质谱仪器由三部分组成：蛋白质芯片阅读器（ProteinChipReader）飞行时间质谱检测系列（PBSIIC系列）分析软件（ProteinChip软件）。操作流程示意图生物初样品（血清/细胞裂解液）：蛋白质通过亲合作用结合到芯片的化学或生物位点上；清洗蛋白质芯片：用水洗去非特异性结合的蛋白质和缓冲液中的杂质，以消除干扰；加能量吸收分子EAM（EnergyAbsorbMolecule）or“Matrix”：芯片经室温干燥后，加能量吸收分子EAM到每个点上，使其与蛋白质结成混合晶体，以促进蛋白质在飞行时间质谱检测中的解吸附和离子化SELDI蛋白质芯片的制备123飞行时间质谱检测激光解吸电离的方法将保留在芯片上的蛋白质解离出来电离的蛋白质可以通过飞行时间质谱被精确地测定出它们的质量ProteinChipReader工作草图ProteinChip

软件化学表面芯片

分为疏水、亲水、阳离子、阴离子和金属离子螯合芯片五种，用于检测未知蛋白，获取指纹图谱。化学表面芯片可以直接用粗生物样品（血清、尿样、体液）进行分析，能同时快速发现多个生物标记物，测定疏水蛋白质特别是膜蛋白。芯片的种类生物表面芯片

生物表面芯片分为抗体－抗原、受体－配体和DNA－蛋白质芯片等种类，可显示与之相结合的抗原或者配体的不同分子量亚型，这种芯片的特异性高，可以定量。

蛋白质芯片系统提供了一个单一、快速和特异的平台，成为蛋白质组学研究的多个领域的强大平台。能够用于下列研究：生物标志物发现、表达差异绘图、作用差异绘图、抗体抗原作用、DNA与蛋白的相互作用、蛋白鉴定和多肽作图、蛋白质纯化、表位作图、糖基化分析、磷酸化/信号传导途径分析、蛋白与蛋白之间作用、受体配体作用、毒性标志物发现、临床数据分析等。在发现生物标志物上的优势抓住了疾病的本质，绝大多数疾病都有特异的生物标志物（Bio-marker），在SELDI技术中质谱的峰值是对这些生物标志物最直接的反映。有一套灵敏的检测系统来检测和识别这些微量的生物标志物。发现生物标志物

能够对许多不同的样品进行比较分析，软件功能强大，分析获得的谱图可以多种形式表示，并应用叠加合成等手段筛选出特别的差异峰，从而确定生物标志物，该方法迅速便捷。蛋白质纯化

提供了便捷的蛋白质纯化方法，能够优化最佳色谱条件（如PH值、洗脱条件），对目的蛋白质进行有效的分离。蛋白质鉴定从蛋白质芯片对结合的蛋白质进行消化，或者事先对蛋白质混合物进行蛋白酶切处理，再结合到蛋白质芯片。结合质谱分析，能够得到消化片段的分子量，从数据库中进行检索就能够获得相应蛋白质的序列信息。分子间作用预先对芯片的点进行处理，偶联抗体或者其他蛋白（或者其他的诱饵分子），制备定制芯片。将待检测包含可能结合分子的溶液与芯片进行杂交，洗脱后对结合上的绑定蛋白质进行质谱分析，获得结合蛋白质的相关信息。转录后修饰

能够确定样品中特定分子量的蛋白质，而这些蛋白质的各种修饰对分子量的改变导致了获得相应峰的位移，从而精确表述蛋白质的修饰状况。临床应用

蛋白质指纹质谱技术目前已经广泛应用于多种疾病，如癌症、老年病、传染性疾病、心血管病和神经系统疾病的临床诊断，其中应用于癌症的最多，被认为是分子医学的一场革新，极大的提高了各种疾病的诊断率。疾病的诊断、疗效监测和预后判断

肿瘤：前列腺癌乳腺癌卵巢癌膀胱癌白血病肺癌脑癌大肠癌其它疾病：急性肾功能衰竭急性心力衰竭,动脉硬化症暴露在空气中的毒素神经精神病学：早老性痴呆忧郁症精神分裂症巴金森氏Huntington’s传染病：HIV鼠疫杆菌Yersiniapestis分支杆菌Mycobacterium柄细菌Caulobacter链球菌Streptococcus肉毒中毒Botulism盶病毒Prions黑死病病毒Yersinia临床诊断肿瘤肝癌甲胎蛋白AFP91%89%

肺癌NSE82%95%

胃癌癌胚抗原CEA91%94%

前列腺癌PSA83%97%

乳腺癌癌抗原CA15393%91%

卵巢癌癌抗原CA12599%99%

肠癌癌胚抗原CEA83%92%

胰腺癌CA19982%85%

膀胱癌尿液检测93%87%鼻咽癌92%97%食道癌84%91%喉癌97%97%肿瘤传统标志物灵敏度特异性SELDI肿瘤蛋白指纹发病机理研究

著名的艾滋病学家何大一教授借助SELDI技术，在3个月内所定了α-defensin1，2，3三种蛋白对艾滋病有抑制作用，这是正常人体内没有的蛋白质，这一发现使研制艾滋病蛋白抑制剂一直成为可能。乙肝病毒感染-肝硬化-肝癌是导致乙肝患者最终死亡的发病三步曲，通过SELDI，检测乙肝病毒携带者、肝硬化及肝癌病人的血清蛋白，发现三种疾病的质谱峰，检测其它样品时灵敏度为80%，特异性为81.8%，这种手段无创伤，并且可以不间断的跟踪检测，为正确治疗提供科学可靠的技术依据。其他应用新药开发与药理学研究，药物毒性实验等，利用SELDI技术可以准确的侧到药物中的特异基因，活性基因与灭活基因。对临床用药具有很好的有指导作用。基础理论研究：蛋白质的纯化，蛋白质的鉴定，蛋白质功能的研究，已知样品中某种功能蛋白，可通过该技术寻找功能蛋白。蛋白质与蛋白质相互作用研究，如有已知抗体、受体酶，可用该技术获得其靶蛋白（抗原、配体和底物），形成DNA或者RNA结合蛋白的研究，确定抗原决定簇，蛋白质磷酸化，糖基化研究，用于寻找与疾病有关的磷酸化，蛋白及新型生物标志物的开发与应用等。GSTPull-Down（谷胱苷肽-S-转移酶沉淀试验）方法寻找结合蛋白ProteinBiochemistryLabNankaiUniversity背景蛋白质间相互作用的研究作为了解蛋白质生物功能的重要手段之一，在功能基因组学研究中极为重要。蛋白质间相互作用存在于机体每个细胞的生命活动过程中。生物学中的许多现象如细胞凋亡、细胞周期调控、信号转导和癌变等均受蛋白质间相互作用的调控。ProteinBiochemistryLabNankaiUniversity简介GSTPull-down技术是近年来发展的一种敏感性及特异性均较高的体外鉴定两蛋白之间相互作用的重要方法1991年由Kaelin的研究组最早应用GSTPull-down技术在混合蛋白溶液寻找到结合蛋白利用谷胱甘肽硫转移酶（glutathioneS-transferase，GST）融合蛋白对谷胱甘肽偶联球珠的亲和性，从可能含有相互作用蛋白的溶液中纯化相互作用的蛋白ProteinBiochemistryLabNankaiUniversity实验步骤原核表达并纯化GST融合的已知蛋白。同时，应用放射性同位素（35S）对细胞裂解物进行标记。将GST融合蛋白与标记好的细胞裂解物混合，同时加入谷胱甘肽偶联球珠，温浴使得融合蛋白的GST能够与球珠结合。通过离心方法收集GST融合蛋白以及与其结合的可能的蛋白分子。在收集到的混合物中加入谷胱甘肽或者直接煮沸，使得目的的混合物能够从球珠上洗脱下来，溶解在SDS上样缓冲液中。将获得的混合物进行SDS电泳，进行放射自显影或者蛋白染色，进而转膜进行Westernblotting实验鉴定。还可应用质谱的方法对找到的结合蛋白进行分析，确定未知蛋白的氨基酸组成，从而找到与已知蛋白结合的因子。ProteinBiochemistryLabNankaiUniversity应用确定融合蛋白与未知蛋白间新的相互作用证实融合蛋白与已知蛋白质间可能的相互作用ProteinBiochemistryLabNankaiUniversityGSTPull-Down检测蛋白的作用原核表达的已知蛋白细胞裂解液中的未知蛋白质应用cDNA文库，进行体外翻译的蛋白质文库中的未知蛋白半定量检测蛋白与蛋白的亲和作用ProteinBiochemistryLabNankaiUniversityGSTProteinXGST35S-labledcelllysate(glutathione-sepharosebeads)(glutathione-sepharosebeads)35S-labledcelllysateGSTProteinXGSTGSTInteractat40CMicrofugetocollectcomplexesProteinBiochemistryLabNankaiUniversity实验步骤123autoradiographAnalyzebySDSLane1.MarkerLane2.GST-proteinXLane3.GSTGSTGSTProteinXProteinBiochemistryLabNankaiUniversity实验步骤prepareproteinextractfrombrainmixandincubateexpressGST-fusionproteininE.colipGEXGSTgeneXProteinBiochemistryLabNankaiUniversityProteinBiochemistryLabNankaiUniversityGST-fusionproteinGSTaloneGSTpulldown验证两种已知蛋白质的相互作用举例inputGSTY-GFP+++X-GSTY-GFPX-GFP+++GSTinput105kDAnti-GFPAnti-GFPY-GSTX-GFPProteinBiochemistryLabNankaiUniversity报告基因系统gene；luciferase；greenfluorescentprotein报告基因(reportgene)是指一组编码易被检测的蛋白质或酶的基因，将其与目的基因融合表达后，可通过报告基因产物的表达来“报告”目的基因的表达调控。这项技术灵敏度高、检测简便可靠、适于大规模生产，因而在监测细胞信号转导，基因表达和药物筛选等方面得到广泛应用。一般的报告基因需要满足以下几个条件：(1)基因被克隆并且已知全序列；(2)宿主不存在报告基因产物或者不存在类似的内源性物质；(3)表达产物易被检测；(4)报告分子的分析结果应具有很宽的线形围，以便分析启动子活性的幅度变化?；(5)报告基因在细胞或动物内表达对其正常的生理作用或活性没有影响。现主要以目前应用最广泛的报告基因荧光素酶和绿色荧光蛋白为例，综述报告基因的新近应用研究进展。1荧光素酶(1uciferase，luc)luc是能催化荧光素或者脂肪醛氧化发光的一类酶的总称。根据来源不同主要分为细菌荧光素酶(bacter