第一章 基因工程的分子生物学基础

第一章基因工程的分子生物学基础授课人：余春梅授课学院:南通大学生命科学学院基因工程的概念细胞外用各种方法产生的核酸分子插入载体分子中，形成遗传物质的新组合，最终整合掺入到本来不含这些核酸分子的宿主生物中，并进行复制繁衍。遗传工程、基因操作、重组DNA技术等基因工程诞生的理论基础----证明了DNA是遗传物质-----双螺旋模型-----遗传密码子的破译1）不同的基因具有相同的物质基础2）基因是可切割的3）基因是可以转移的4）多肽与基因之间存在对应关系5）遗传密码是通用的6）基因可以通过复制把遗传信息传递给下一代。基因工程的技术基础工具酶：DNA连接酶内切酶反转录酶PCR技术载体技术基因转移技术第三节基因工程中采用的主要酶类一、序列特异的DNA限制性内切核酸酶

λ噬菌体E.coli菌株λKλCλBK110-410-4C10-4110-4B111（一）限制性内切酶的发现

—宿主细胞的限制和修饰作用1、宿主细胞的限制和修饰作用：两种不同来源的入-噬菌体λK；λC，能高频感染各自大肠杆菌宿主细胞（K株，C株）。当它们分别与其它宿主菌交叉混合培养时，感染下降数千倍。一但λK噬菌体在C株成功，由C株繁殖出λK后代，能感染C株,不能感染原来K株.(二)限制和修饰作用的分子机制1．大肠杆菌宿主细胞K株，C株，有各自的限制和修饰系统。1）

它们均有三个连续的基因位点控制，hsdR;hsdM;hsdS.2）

hsdR编码限制性核酸内切酶---识别DNA分子特定位点，将双链DNA切断。3）

hsdM编码产物是DNA甲基化酶---催化DNA分子特定位点的碱基甲基化反应。4）

hsdS表达产物的功能是---协助限制性核酸内切酶和甲基化酶，识别特殊的作用位点。(二)、限制和修饰作用的分子机制2.入噬菌体长期生长在大肠杆菌宿主细胞K株，C株中，1）宿主细胞甲基化酶，将染色体DNA和噬菌体DNA特异性保护.2）封闭自身所产生的核酸内切酶的识别位点（修饰）3．当外来DNA入侵时，遭到宿主限制性内切酶的特异降解（限制）4.由于降解不完全，外来少数DNA分子在宿主细胞中繁殖过程中被宿主细胞的甲基化酶修饰，虽然是外来却不被降解。5．但丧失在原宿主细胞中的存活能力，因为接受了新宿主菌甲基化修饰的同时丧失了原宿主菌修饰的标记(一但λK噬菌体在C株成功，由C株繁殖出λK后代，能感染C株,不能感染原来K株)6．细菌利用限制和修饰系统来区分自身DNA与外来DNA。B株不能产生限制性内切酶，其它来源入-噬菌体可以感染B株，在B株繁殖，入-噬菌体则在K株和C株受到严格的限制作用(二)限制和修饰作用的分子机制(三)限制性内切酶的分类I类酶II类酶III类酶酶分子三亚基双功能内切酶与甲基化酶分离二亚基双功能识别位点二分非对称序列4-8bp序列，回文结构5-7bp非对称序列切割位点距识别位点1000bp在识别位点中或靠识别位点在识别位点下游24-26bp限制性反应与甲基化反应互斥分开反应同时竟争限制作用需要需要不需要（四）限制性内切酶Ⅱ切割特点1、识别位点一般为4-8个bp的回文序列大多数酶作用于底物DNA双链，位点在识别序列中或靠近识别序列少数酶能作用于回文序列相应DNA单链序列限制性内切酶Ⅱ切割特异位点的机理（四）限制性内切酶Ⅱ切割特点平末端：两条链上的断裂位置是处在一个对称结构的中心，形成的DNA片段具有平末端。黏性末端：指DNA分子在限制酶的作用下形成的具有互补碱基的单链延伸末端结构，它们能够通过互补碱基间的配对而重新环化起来。

5’突出的黏性末端

3’突出的黏性末端平末端的DNA片段不易重新环化已知有两种不同的限制酶都可产生粘性末端：5’-P端突出：3’-OH端突出：同尾酶一组来源不同识别序列各异的，但能够切割形成相同粘性末端的核酸内切限制酶。HindⅢ5’-A

AGCTT-3’3’-TTCGA

A-5’HsuI5’-A

AGCTT-3’3’-TTCGA

A-5’同裂酶（isoschizomers）有一些来源不同的限制性内切酶能识别并切割相同的核苷酸靶序列，这类酶称为同裂酶。限制酶识别与切割的靶点序列及其随后的连接同DNA的来源无关，即不带有种的特异性，对各种DNA普遍适用。根据这一特性，才能将不同来源的DNA片段重组成新的重组体分子或是新的基因。从生物秀网站下载二、连接酶（一）DNA连接酶的作用模式1、连接酶：能够催化两条双链DNA链之间形成5′，3′磷酸二酯键的酶5’－末端形成DNA－腺苷酸复合物（二）DNA连接酶的两种类型类型I：E.coliDNA连接酶（只连接粘末端）利用NAD（烟酰胺腺嘌呤二核苷酸）作为能量供体，主要来源于原核生物类型II：T4DNA连接酶（粘末端和平末端）

利用ATP作为能量供体，主要来源于真核生物，T4噬菌体也属于此类在基因工程的实验中主要用T4DNA连接酶（三）条件（1）连接所需的条件一条DNA链的3’末端具有一个游离的羟基（-OH），而在另一条DNA链的5’末端具有一个磷酸基团（-P）；（2）需要有一种能源分子存在以提供羟基与磷酸基团之间形成磷酸二酯键时所需的能量。大肠杆菌及其它细菌中：NAD+（氧化氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸）动物细胞及噬菌体中：ATPOH3’5’P（四）注意被连接的两条DNA链必须是双螺旋DNA分子的一部分，DNA连接酶并不能连接两条单DNA分子或环化的单链DNA分子。DNA连接酶只能连接并封闭双螺旋DNA分子所出现的切口（Nick），即封闭双链DNA上两个相邻核苷酸之间失去一个磷酸二酯键所出现的断裂GGTAC-OHP-CC-PHO-CATGG5’3’3’5’GG-OHP-CCCCATGG5’3’3’5’GGTACCCCATGG5’3’3’5’三、激酶及碱性磷酸酯酶碱性磷酸酯酶：除去DNA5′磷酸的酶激酶：在DNA或RNA的5′羟基(OH)端进行磷酸化的酶（作用结果是添加磷酸，可用于核酸的末端标记）四、DNA聚合酶和RNA聚合酶DNA聚合酶Ⅰ（来自大肠杆菌）功能：5’→3’的聚合酶活性。5’→3’外切核酸酶活性，3’→5’外切核酸酶利用：5’→3’的聚合酶活性以及5’→3’外切核酸酶活性，切口平移大片段（Klenow片段）：5’→3’的聚合酶活性，3’→5’外切核酸酶小片段DNA聚合酶ⅠTaqDNA聚合酶（来自耐热细菌）具有5’→3’的聚合酶活性和3’→5’外切核酸酶，高度保真，产生平末端，不能进行TA克隆测序酶：具有5’→3’的聚合酶活性，但不具备3’→5’外切核酸酶的T7DNA聚合酶。反转录酶：以RNA为模板合成DNA的聚合酶第四节研究DNA和RNA的方法一、核酸的分离纯化通过各种方法将生物材料破碎，释放DNA（RNA）至溶液中，去除杂质（如用苯酚萃取蛋白质），再用乙醇沉淀核酸，通过离心，分离纯化核酸，最后用低浓度盐溶液溶解核酸。1、细菌培养物的生长和收集确定成分的培养基(definedmedium)，M9不确定成分的培养基(undefinedmedium)，如LB蛋白胨：提供氨基酸和小的肽段酵母提取物：提供氮源，糖类以及其它有机与无机营养实例1：细菌DNA的提取2、细胞提取物的制备细菌细胞的屏障:细胞膜和细胞壁物理方法与化学方法化学方法:溶菌酶(消化细胞壁多聚物)EDTA(螯合钙离子,抑制DNA酶的活性)SDS:去污剂,协助细胞壁的裂解实例1：细菌DNA的提取3从细胞提取物中纯化DNA降解杂质,留下DNA(苯酚与氯仿的混合物,RNA酶)离子交换层析,分离DNA(带正电荷的离子交换剂)4DNA取样的浓缩乙醇沉淀(破坏了DNA分子间的氢键)5DNA浓度的测量A260/A280=1.8实例1：细菌DNA的提取植物叶片用液氮碾磨成细末后转移到1.5ml离心管加650μl在65度预热的CTBA提取液水浴锅中65温浴40分钟后取出，静置冷却加入650μl苯酚：氯仿（1：1）混合液，上下颠倒混匀，静置5分钟12000rpm离心10分钟实例2：植物DNA的提取取上清液，加入2μl（10mg/ml）Rnase,37度水浴30分钟再抽提一次取上清液，加入2倍体积的冷乙醇或等体积的异丙醇轻轻摇动，待发现有白色絮状沉淀，用牙签挑出或6000rpm离心5分钟70%的乙醇洗后，凉干。

实例2：植物DNA的提取实例3质粒DNA的制备1基于分子大小的分离2基于构象的分离质粒有三种构型cccDNA(共价闭环DNA)：DNA的两条链都是完整的。ocDNA(开环DNA)：只有一条链是完整的。线性DNA：DNA的两条链均被打开。多种细菌中存在线性的质粒DNA。但末端或是通过重复序列形成发卡结构或通过共价结合蛋白进行保护，避免核酸酶的降解。超螺旋DNA松弛cccDNA开环DNA核酸内切酶DNA连接酶核酸内切酶DNA促旋酶拓扑异构酶碱变性用CsCl-EB等密度离心UpperbandcontainingchromosomalDNAandopenplasmidcirclesLowerbandofcovalentlyclosedcirclesplasmidDNAEthidiumbromide(EB)包含质粒的细胞用溶菌酶弱化细胞壁，用NaOH和SDS溶液裂解变性的染色体DNA用acidicsodiumacetate中和染色体DNA复性形成不溶的网状物高浓度的acidicsodiumacetate使protein-SDS复合物和高分子量的RNA沉淀cccDNA不发生变性，以天然状态溶解在溶液中通过离心去除沉淀通过乙醇或异丙醇浓缩沉淀，或用凝胶过滤方法纯化质粒DNA。二、凝胶电泳根据DNA或RNA分子的大小，形状和拓扑结构，将DNA和RNA进行分离的技术。DNA和RNA在胶上的迁移性

DNA或RNA分子带有负电荷，在胶支