鼠疫间接血凝试验和反相血凝试验

间接血凝试验和反相血凝试验

祁腾

四川省疾病预防控制中心11、鼠疫血清学检验的发展过程1.1二十世纪初鼠疫的诊断主要靠分离病原菌鼠疫菌多在动物鼠疫流行时才可分离到，某些因素如被检材料的腐败程度，鼠疫病人取材前用过抗菌素，鼠疫菌的毒力等都不同程度地影响鼠疫菌的分离。仅靠分离鼠疫菌的方法对鼠疫病人诊断、进行病原检索、动物鼠疫调查等已不能解决问题。后来，发展了细菌凝集和热沉淀反应测定鼠疫抗体或抗原，但由于这些反应特异性差，敏感性低，只能作为辅助诊断方法之一21.2二十世纪50年代以后

Baker提取出了具有特异性的鼠疫菌FI抗原利用鼠疫菌FI抗原或特异性抗体吸附于颗粒性载体（血球、乳胶、炭颗粒等），形成间接血凝试验技术后来，用单宁酸处理红血球，再吸附FI抗原，提高了敏感性和特异性，WHO（1956）推荐列为鼠疫诊断常规方法之一31.3二十世纪70年代初鼠疫间接血凝技术在我国得到推广，并大规模用于实践之后用于检查抗原的鼠疫反向血凝试验，也陆续出现我国制备的鼠疫抗体致敏血球可检查2.4万个菌/ml，其特异性和敏感性可与WHO提供的制剂相媲美，已在国内广泛应用42.1血清学检测是依据抗原或抗体与其相对应的特异抗体或抗原在一定条件下（如适宜的反应介质和温度）可发生免疫化学反应，生成特异的抗原—抗体复合物。主要有直接凝集和间接凝集2、血清学检测的原理52.1.1直接凝集

颗粒性的抗原与相应的抗体反应时，抗原与抗体结合并逐步形成肉眼可见的大凝集块的反应2.1.2间接凝集

水容性抗原与抗体发生免疫反应时，形成抗原-抗体复合物，是肉眼不可见的，需加入相应的载体，借助载体的凝集出现可见反应63、间接红血球凝集试验（IHA）3.1间接凝集反应以红细胞作为载体，当红细胞表面吸附了可溶性抗原时，称为致敏的红细胞，它与相应抗体发生凝集，称为间接红血球凝集试验(IHA)，它是一种敏感性高、特异性强的血清学诊断方法3.2由于红细胞被动地凝集在一起，故又称为被动血凝试验（PHA)73.3间接血凝实验的特点3.3.1敏感性高，可检测出微量抗原3.3.2时间短、快速：在2h内可出结果3.3.3特异性好：FI抗原抗体反应特异性高，与假结核血清出现交叉反应不超过1：5；诊断制剂制作简单、稳定3.3.4抗原（抗体）致敏血球可冷藏保存1-2年，敏感性和特异性不受影响83.4间接血球凝集试验多用于3.4.1疑似鼠疫患者的诊断和追溯诊断3.4.2开展动物鼠疫流行调查和流行规律的调查3.4.3用于实验研究，观察抗体的产生3.4.4对鼠疫菌苗和菌苗免疫效果进行评价等方面

94、间接血球凝集抑制试验

4.1初筛阳性的血清经二倍系列稀释后，在每个稀释孔加入一定量的鼠疫F1抗原，进行中和后。再加入吸附鼠疫F1抗原的红血球，观察是否还出现凝集现象，这一方法称间接血凝抑制试验

4.2如没有出现血球凝集现象，可以说明血清中的抗体是鼠疫F1抗体，因为加入的抗原是已知的FI特异抗原，这一结果称间接血凝抑制试验阳性

105、反向血球凝集试验5.1反向血球凝集试验是相对于间接血球凝集试验而言。将已知鼠疫FI抗体吸附在绵羊血球上，按相同的方法操作，检测样品中的鼠疫FI抗原是否存在，此方法称为反向血球凝集试验。其操作、凝集相及判定标准与间接血球凝集试验完全相同5.2反向血凝试验多用于：分离鼠疫菌困难的情况下；对疑似鼠疫病人的诊断、动物鼠疫的判定

116、反向血球凝集抑制试验6.1与间接血球凝集抑制试验的原理相同其方法是用被检材料浸出液二倍系列稀释，每孔先加入高效价鼠疫诊断血清（鼠疫F1抗体）进行中和，再加入吸附鼠疫F1抗体的红血球，观察是否还出现凝集现象。这一方法称反向血凝抑制试验6.2如果没有出现原来阳性的凝集相或从某一稀释度之后出现阴性结果，为反向血凝抑制试验阳性127、鼠疫血清学检测方法137.1间接血球凝集试验(IHA)的

操作方法147.1.1实验用品的准备与处理7.1.1.1玻璃器皿如新购置玻璃器皿，应以2%HCl浸泡2小时，以除去游离碱，清洗干净后干烤灭菌方可使用。每次试验后应放入消毒液中浸泡12-24小时后，清洗干净，再用自来水和蒸馏水冲洗，干烤或凉干后使用7.1.1.2一次性用品

一次性微量血凝板，吸头等要一次性使用，不要重复用7.1.1.3高值用品

加样器、离心机等仪器、设备，要爱护，定期对准确性进行检测151617187.1.2.1试剂1）鼠疫F1抗原致敏血球抗原致敏血球为戊二醛固化并经单宁酸处理的羊血球，再以33%饱和度硫酸铵两次盐析提纯的FI抗原致敏。用于间接血凝试验的抗原致敏血球应定期进行试剂质量检测，并符合以下标准a)用细菌凝集效价为1∶320的鼠疫全菌免疫血清，血凝滴度应不低于1∶40000b)与假结核血清交叉滴度应不高于1∶52）单宁酸血球

与鼠疫F1抗原致敏血球同一批次的单宁酸血球3）稀释液含1%正常兔血清的生理盐水4）抑制剂含50ug/mL～100ug/mL鼠疫F1抗原的稀释液5）阳性参考血清7.1.2间接血凝试验：测定鼠疫抗体197.1.2.2标本的准备血清标本应经56℃30分钟灭活，4℃保存、待检，如需长期保存则加入叠氮钠（终浓度为0.1%)或1%硫柳汞（终浓度为1/5000--1/10000）

20217.1.2.3操作步骤7.1.2.3.1初筛试验操作步骤1）每份被检血清在V型孔微量血凝板稀释5孔2）用移液器向每孔分别加入25μL稀释液3）在第1孔中加入被检血清25μL，吸排4～6次，充分混匀后，取25μL移至第2孔，充分混匀，依次稀释至最后一孔，弃掉25μL4）分别在各孔内加入1%鼠疫F1抗原致敏血球25μL，振荡混匀。置37℃温箱或室温2h后观察结果227.1.2.3.2结果判定1）“＃”：凝集血球铺满孔底，有明显折边，抗体过量时，凝集呈疏松花圈状

2）“＋＋＋”：凝集血球铺满孔底，无折边3）“＋＋”：血球不完全凝集，在孔底呈整齐的圆圈，但圈内外有非常明显的血球凝集

4）“＋”：在孔底形成较小的圆圈，在圈内外只有很少的血球凝集5）“–”：血球全部沉积在V型孔的底部，呈整齐的小珠状

呈现“++”以上的凝集现象时，进行以下复判操作

2324257.1.2.3.3复判操作步骤1）每份初筛阳性的血清在V型孔微量血凝板稀释两列，第一列为血凝抑制试验列，第二列为血凝试验列2）用移液器向第一列每孔内加抑制剂25μL，向第二列每孔内加稀释剂25μL3）用移液器分别取被检血清25μL加入各列的第一孔内，吸排混匀4～6次,，再吸取25μL加入相应列的第二孔内，混匀。依此类推稀释至最后一孔，吸出25μL弃入消毒液中。置37℃温箱10min～15min4）在第一、二列各孔中，用移液器加入稀释至1%的鼠疫F1抗原致敏血球悬液25μL。震荡混匀，置37℃2小时后观察结果。至此，每列第1孔的稀释度为1：426

5）每组同时设下列对照

a）空白对照：稀释液25μL+1%鼠疫F1抗原致敏血球25μLb）阴性对照：1：20被检血清25μL+1%单宁酸血球25μLc）阳性对照：稀释的阳性参考血清＋1%鼠疫F1抗原致敏血球25μL6）结果判定方法同7.1.2.3.2

空白对照、阴性对照孔不应呈现凝集，阳性对照成立。最终结果，当血凝抑制列呈“++”凝集的孔比血凝试验列少2孔以上，判定为特异性凝集。阳性血清最终效价为凝集排呈现“++”的最高稀释度27287.1.3反向间接血球凝集试验（RIHA）：测定鼠疫菌FI抗原7.1.3.1试剂1）鼠疫FI抗体致敏血球

2）抑制剂为1：100稀释的鼠疫免疫血清3）阳性对照血清：阴性混合血清加F1抗原至1mg/mL，1：100稀释后作为阳性对照

297.1.3.2准备标本待查患者可采取血清、淋巴穿刺液、咽拭子浸出液、脑脊液等液体标本，也可采取血块等组织标本。尸检则采取各有关的组织标本。将组织标本在灭菌容器中制成悬液，加9倍组体积的稀释液（加5%甲醛）混悬，静置，取上清液作为1：10标本307.1.3.3操作步骤7.1.3.3.1初筛试验操作步骤1）每份被检液在V型孔微量血凝板稀释5孔2）用移液器向每孔分别加入25μL稀释液3）在第1孔中加入被检液25μL，吸排4～6次，充分混匀后，取25μL移至第2孔，充分混匀，依次稀释至最后一孔，弃掉25μL4）分别在各孔内加入1%鼠疫F1抗体致敏血球25μL，振荡混匀。置37℃温箱或室温2h后观察结果7.1.3.3.2结果判定:方法同间接血凝初筛试验（7.1.2.3.2）317.1.3.3.1复判操作步骤1）每份初筛阳性的被检材料在V型孔微量血凝板做二列复判试验，第一列为抑制列，第二列为凝集列2）用移液器向抑制列每孔加入25μL抑制剂，向凝集列每孔加25μL稀释液3）分别向每列第1孔中加入被检液25μL，两列分别进行倍比稀释，方法同7.1.2.3.3中3），至每列最后一孔弃25μL,室温作用15min4）各孔内加入1%鼠疫F1抗体致敏血球25μL，振荡混匀，置37℃温箱或室温2h后观察结果

325）设置对照：a）空白对照：稀释液25μL+1%鼠疫F1抗体致敏血球25μLb）阴性对照：被检液25μL+1%单宁酸血球25μLc）阳性对照：阳性对照血清+1%鼠疫F1抗体致敏血球25μL6）结果判定:方法同间接血凝（7.1.2.3.2

）

最终结果，空白对照、阴性对照孔不出现凝集现象，阳性对照成立。当抑制列呈“++”凝集的孔比试验列少2孔以上，判定为特异性凝集阳性最终效价为凝集排呈现“++”的最高稀释度337.1.4血凝试验结果的分析和判定1）抑制列－－－－－对照－血凝列#+++

++

+－结果：阳性，滴度（++）2）抑制列－－－－－－对照－血凝列+－－－－－

结果：阴性3）抑制列#++

－－－－－－血凝列###+++++++++－对照－

结果：阳性，滴度（++）4）抑制列++++++++

血凝列++++++++对照++

非特异性凝集347.1.5鼠疫血清学阳性结果判定1）IHA1:16（++）以上；RIHA1:100（++）2）双份血清（间隔10天）用IHA法检测FI抗体，呈4倍以上增长357.1.6血凝试验的有关注意事项7.1.6.1试验用器材、量具要准确、清洗要干净；使用过的，要洗净后再用蒸馏水冲洗1—2次，防止残留的消毒液、洗液及阳性材料造成假阳性。最好能干烤或高压处理，不能干烤或高压的可重复使用的器材用0.2%稀盐酸浸泡2小时以上处理。7.1.6.2微量血凝试验要使用一次性的“V”型微量血凝板。使用移液器加试剂。吸头也要使用一次性的，应与移液器配套。滴加各种试剂要准确，防止交叉污染。使用的用具、每次稀释后弃掉的25ul液