课题2土壤中分解尿素的细菌的分离和记数

在PCR技术中离不开耐高温的DNA聚合酶。找到这种耐高温的聚合酶是PCR成功与否的关键，在哪些生物中可找到这种聚合酶呢？为什么？这给大家带来了什么启示呢？如：细菌。

在实验室中微生物的筛选时，人为提供有利于目的菌株生长的条件（如营养、温度、ＰＨ值），同时抑制或阻止其他微生物生长。可以试图从那些耐高温的生物中去寻找。这说明，在寻找目的菌株时，要根据其对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。课题二土壤中分解尿素的细菌的分离与计数一、研究思路（一）筛选菌株分析右边培养基配方，回答下面的问题：１、在该培养基的配方中，为微生物的生长提供碳源和氮源的分别是什么物质？２、绝大多数微生物都能利用葡萄糖，但是，只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素。请你分析该培养基的配方，想一想这种培养基对微生物是否具有选择作用？如果具有，又是如何进行选择的？１、在该培养基的配方中，为微生物的生长提供碳源和氮源的分别是什么物质？碳源：葡萄糖氮源：尿素２、绝大多数微生物都能利用葡萄糖，但是，只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素。请你分析该培养基的配方，想一想这种培养基对微生物是否具有选择作用？如果具有，又是如何进行选择的？具有选择作用。因为尿素是该培养基的唯一氮源，只有能够利用尿素的微生物才能在该培养基中生长。选择培养基：在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基。（二）统计菌落数目阅读教材P22“统计菌落数目”，思考以下问题：１、可以利用哪些方法来统计样品中活菌数？２、为什么稀释涂布平板法能进行微生物的统计？３、如何利用稀释涂布平板法统计微生物数量？４、教材中的事例中哪位同学的统计更准确？５、利用稀释涂布平板法统计出微生物数量与实际数目相比是多了还是少了？１、可以利用哪些方法来统计样品中活菌数？可用稀释涂布平板法和显微镜直接记数法统计样品中的微生物数量。２、为什么稀释涂布平板法能进行微生物的统计？因为在样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，么通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。为了保证结果准确，一般选择菌落数在３０～３００的平板进行记数。３、如何利用稀释涂布平板法统计微生物数量？４、教材中的事例中哪位同学的统计更准确？第一位同学只涂布了一个平板，没有设置重复组，因此结果不具有说服力。第二位同学考虑到设置重复组的问题，涂布了3个平板，但是，其中1个平板的计数结果与另2个相差太远，说明在操作过程中可能出现了错误，因此，不能简单地将3个平板的计数值用来求平均值。这个实例启示我们，在设计实验时，一定要涂布至少3个平板，作为重复组，才能增强实验的说服力与准确性。在分析实验结果时，一定要考虑所设置的重复组的结果是否一致，结果不一致，意味着操作有误，需要重新实验。５、利用稀释涂布平板法统计出的微生物数量与实际数目相比是多了还是少了？利用稀释涂布平板法统计出的活菌数量往往比活菌的实际数目低。这是因为当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。所以，统计结果一般用菌落数而不是活菌数来表示。（三）设置对照阅读教材p22“设置对照”，思考以下问题：１、什么是对照实验？2、设置对照的目的是什么3、A同学的实验没有说服力的原因是什么？如何改进？１、什么是对照实验？对照实验是指除了被测试的条件以外，其他条件都相同的实验，其作用是比照实验组，排除任何其他可能原因的干扰，证明确实是所测试的条件引起相应的结果。2、设置对照的目的是什么设置对照的主要目的是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。3、A同学的实验没有说服力的原因是什么？如何改进？没有设置对照，不能排除其他因素对本实验的影响。A同学的结果与其他同学不同，可能的解释有两种。一是由于土样不同，二是由于培养基污染或操作失误。实验方案有两种。一种方案是可以由其他同学用与A同学一样的土样进行实验，如果结果与A同学一致，则证明A无误；如果结果不同，则证明A同学存在操作失误或培养基的配制有问题。另一种方案是将A同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培养，作为空白对照，以证明培养基是否受到污染。通过这个事例可以看出，实验结果要有说服力，对照的设置是必不可少的。怎么证明？二、实验设计实验流程示意图：取样稀释培养与观察（一）土壤取样阅读资料一，思考：1、土壤微生物有什么特点？2、如何进行土壤取样？1、土壤微生物有什么特点？土壤是微生物的天然培养基，土壤中的微生物数量大，种类多。土壤微生物主要分布在富含有机质的土壤表层。土壤微生物中，大约70%~90%是细菌。细菌适宜在酸碱度接近中性的潮湿土壤中生长，绝大多数分布在距地表约3~8厘米的土壤层。2、如何进行土壤取样？土壤取样时，一般要铲去表层土。在城市，常取公园、街道旁、花盆中的土壤。在农村，常收集农田或菜园里的土壤。（二）样品的稀释阅读资料二，思考：为什么分离不同的微生物要采用不同的稀释度？测定土壤中细菌的总量和测定土壤中能分解尿素的细菌的数量，选用的稀释范围相同吗？这是因为土壤中各类微生物的数量（单位：株/g）是不同的，例如在干旱土壤中的上层样本中：好氧及兼性厌氧细菌数约为2185万，放线菌数约为477万，霉菌数约为231万。因此，为获得不同类型的微生物，就需要按不同的稀释度进行分离，同时还应当有针对性地提供选择培养的条件。（三）微生物的培养与观察不同种类的微生物，一般需要不同的培养温度和培养时间。细菌一般在30~37℃的温度下培养1~2天；放线菌一般在25~28℃的温度下培养5~7天；霉菌一般在25~28℃的温度下培养3~4天。在实验观察时，可以每隔24小时统计一次菌落数目,选取菌落数目稳定时的记录作为结果,这样可以防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目

一般来说，在一定的培养条件下（相同的培养基、温度及培养时间），同种微生物表现出稳定的菌落特征。这些特征包括菌落的形状、大小、隆起程度和颜色等方面。在观察菌落时,一定要仔细,最好以表格的形式将不同菌落的特征记录下来。四、课题成果评价（一）培养物中是否有杂菌污染以及选择培养基是否筛选出菌落

对照的培养皿在培养过程中没有菌落生长，说明培养基没有被杂菌污染。牛肉膏培养基的菌落数目明显大于选择培养基的数目，说明选择培养基已筛选出一些菌落。（二）样品的稀释操作是否成功如果得到了2个或2个以上菌落数目在30～300的平板，则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数。（三）重复组的结果是否一致如果选取的是同一种土样，统计的结果应该接近。如果结果相差太远，就要分析产生差异的原因。五、课题延伸——如何鉴定能分解尿素的细菌？原理：在细菌分解尿素的化学反应中，细菌合成的脲酶将尿素分解成了氨。氨会使培养基的碱性增强，PH值升高。因此，可以通过检测培养基PH的变化来判断该化学反应是否发生。方法：在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，培养某种细菌后，如果PH升高，指示剂将变红。（四）实验方案课题：土壤中某样品细菌的分离与计数实验的具体操作步骤：1土壤取样从肥沃、湿润的土壤中取样。先铲去表层土3cm左右，再取样，将样品装入事先准备好的信封中。2制备培养基准备牛肉膏蛋白胨培养基和选择培养基。将菌液稀释相同的倍数，在牛肉膏蛋白胨培养基上生长的菌落数目应明显多于选择培养基上的数目，因此，牛肉膏蛋白胨培养基可以作为对照，用来判断选择培养基是否起到了选择作用。由于初次实验，对于稀释的范围没有把握，因此选择了一个较为宽泛的范围：稀释倍数为103～107。每个稀释度下需要3个选择培养基，1个牛肉膏蛋白胨培养基，因此共需要15个选择培养基，5个牛肉膏蛋白胨培养基。此外，还需要准备8个灭菌的试管和1个灭菌的移液管。3微生物的培养与观察：参考课本中图2-7的实验流程示意图，将10g土样加入盛有90mL无菌生理盐水的锥形瓶中（锥形瓶体积为250mL），充分摇匀，吸取上清液1mL，转移至盛有9mL的生理盐水的无菌大试管中，依次等比稀释至107稀释度，并按照由107～103稀释度的顺序分别吸取01mL进行平板涂布操作。按照浓度从低到高的顺序涂布平板，不必更换移液管。将涂布好的培养皿放在30℃温度下培养。随着培养时间的延长，会有不同的菌落产生。比较牛肉膏培养基和选择培养基中菌落的数量、形态等，并做好记录。挑选选择培养基中不同形态的菌落接入含酚红培养基的斜面中，观察能否产生如课本中图2-10的颜色反应。4细菌的计数

当菌落数目稳定时，选取菌落数在30～300的平板进行计数。在同一稀释度