钙网蛋白n端氨基酸的克隆及原核表达

钙网蛋白n端氨基酸的克隆及原核表达

肿瘤的生长和转移取决于新血管的生成，提供足够的血液，并从癌组织那里获得必要的养分和氧气。寻找高效、低毒血管生成的抑制因素，抑制肿瘤血管生成，是当前肿瘤研究领域的热点之一。在20世纪末，我们发现了几个内源性血管生成的抑制因素，如aneistati、refine、costati和thoret。与传统的抗癫痫药物不同，这些抗癫痫药物没有具有抗药性和很低的毒性，但这些蛋白质因素的分子质量高，不利于血管生成和实验肿瘤的生长。它可以作为一个重要的内皮细胞瘤的生长和血管的生成。为了研究crt及其n区（1.180个氨基酸）的不同功能，发现了c-c1（137个氨基酸）和氨基c-c1（27个氨基酸）。钙和中间的铬酸盐具有两个重复序列的p区。为了研究crt及其n区（1.180个氨基酸），它可以单独抑制内皮细胞的生长和血管的生成。为了通过蛋白质分析软件对crtn段（1.180个氨基酸）的可能活动功能进行分析，并应用pcr技术对crtn段（12280个氨基酸）的编码权限进行分析，以确定crtn段（n58）可用于牛仔布斯特。对杆状骨。1材料和方法1.1材料表面1.1.1蘑菇和颗粒菌株E.coliDH5α和E.coliBL21(DE3)为本室保存,质粒pET-3c由暨南大学生物工程中心转赠.1.1.2患者细胞株鉴定海兰种蛋由佛山畜牧有限公司供给;黑色素瘤细胞株(B16)、人脐静脉内皮细胞株(ECV304)、人胚肺成纤维细胞株(HLF)、人乳腺癌细胞株(MCF-7);C57/BL小鼠,雄性,6～8周龄,体重18～20g购于中山大学医学院动物实验中心.1.1.3试剂及pcr引物限制性内切酶,T4DNA连接酶及其他限制性修饰酶购自GIBCO-BRL公司,dNTP、PCR试剂盒及DNA回收试剂盒为Roche公司产品.Tricine,MTT及IPTG购自Sigma公司,PCR引物由上海博亚公司合成,胎儿组织总cDNA购自Clontech公司.1.2方法1.2.1通过提取物质和酶切dna、连接dna和转化阐明竹肠菌按文献方法进行.1.2.2pcr扩增crtn区的n65dna序列先从人胎肝总cDNA中用PCR扩增人钙网蛋白cDNA,然后以CRTcDNA为模板,通过PCR扩增CRTN区的N58DNA序列.扩增条件为第一循环94℃5min,60℃1min,72℃1min;第二循环开始每个循环94℃1min,60℃1min,72℃1min共30个循环.PCR产物的DNA序列分析由博亚生物技术有限公司完成.1.2.3sds-聚丙烯酰胺凝胶电泳sds-东南角将含N58DNA序列的重组质粒转化E.coliBL21(DE3),在含氨苄青霉素(Amp)(100mg/L)的平板上筛选转化子,挑取转化子单菌落接种于含Amp(100mg/L)的2×YT培养基中,37℃振荡培养过夜,次日转接至新鲜的2×YT培养基中,37℃培养至A600=0.5,加IPTG至终浓度为0.4mmol/L,继续培养6h.取1ml培养液离心收集菌体,悬浮于40μlTE缓冲液,加等体积2×上样缓冲液100℃煮沸5min,取10μl进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS)分析.1.2.4sds-东南角分析菌体悬浮于STE中,用超声波破碎,离心收集沉淀即为粗制包涵体.用含有0.05%TritonX-100的4mol/L尿素反复洗涤包涵体,除去细胞碎片、核酸等杂质.纯净的包涵体溶于变性液(50mmol/LTris,10mmol/LEDTA,8mol/L尿素,0.5%β-巯基乙醇)中,室温下放置过夜进行变性溶解.次日,离心除去不溶物质,上清液在磁力搅拌下缓慢加入20倍体积复性缓冲液(50mmol/LTris-1mmol/LEDTA-2mmol/L还原型谷胱甘肽-1mmol/L氧化型谷胱甘肽),室温过夜进行复性.复性液用MilliporeTFF超滤器浓缩并除去尿素等部分杂质.超滤液上SephadexG75层析柱(1.6cm×50cm),样品4ml,用50mmol/L的pH8.0Tris-HCl平衡和洗脱,每管2ml,共收集20管,用考马斯亮蓝G250检测,含蛋白质的管进行SDS分析.1.2.5细胞活力试验rpmi-1330采用MTT法,实验用细胞均培养在含10%小牛血清,100U/ml青霉素和100mg/L链霉素的RPMI-1640培养液中至对数生长期,用0.25%的胰蛋白酶消化成单细胞悬液,再用RPMI-1640培养液调节细胞浓度为3×104～5×104个/ml.按0.1ml/孔细胞悬液的量加入96孔细胞培养板.按试验设计每组为3个重复孔,空白对照孔不加细胞,在37℃5%CO2中培养24h,更换新鲜培养液,试验组各加入0.05mlN58蛋白样品,培养72h后,加入0.02mlMTT,继续培养4h后,吸去上清,加0.1mlDMSO,振荡10min,测A570.1.2.6样品制备和n65蛋白表达选用孵育6天的鸡胚,以灭菌滤纸片(0.5mm×0.8mm)作为样品载体,对照组(n=5)加入10μlPBS溶液,实验组(n=5)加10μl浓度为0.5g/L的N58蛋白样品,培养48h观察结果.1.2.7图像见表1接种0.2ml细胞浓度为0.5×106个/ml的B16黑色素瘤细胞于C57BL/6小鼠的右前肢跟部上方.待瘤体长出后用游标卡尺测量肿瘤的长径(L)和短径(W),按公式V=1/2LW2计算瘤体积,单位mm3.待肿瘤长至100mm3左右时,将C57BL/6小鼠随机分组:实验组(n=5)在靠近肿瘤部位皮下注射100μg(0.2ml)待测样品;对照组(n=4)皮下注射0.2ml的PBS.每24小时重复注射一次,持续8天,观察肿瘤生长情况,测量肿瘤体积,然后取出肿瘤称重,计算抑瘤率,2结果2.1n58敦a段的克隆2.1.1pcr索引的合成根据已发表的CRTcDNA的序列合成了如下两对PCR引物.2.1.2pcr扩增n65先以P1、P2为引物用PCR技术从人胎脑总cDNA中扩增CRTcDNA,经序列分析后克隆至pUC19的SacⅠ和XbaⅠ位点,然后以CRTcDNA为模板,P3、P4为引物扩增N58DNA片段.经琼脂糖凝胶电泳分析,扩增产物约为200bp(图1),DNA序列分析结果如图2.PCR产物大小为206bp,除去两端的限制酶切位点和终止密码,实际的编码区为177bp,相当于CRT的N端122～180位氨基酸(图2).2.2质粒pet-n65PCR产物经DNA回收试剂盒纯化和序列分析后,用NdeⅠ和BamHⅠ酶切后,与同样经过NdeⅠ和BamHⅠ酶切的质粒pET-3c连接,获得N58DNA的表达载体pET-N58(图3).根据pET-3c图谱和序列分析,pET-3c经过XbaⅠ和EcoRⅠ双酶切应切出一条589bp的小带,而重组质粒pET-N58应切出一条766bp的小带,图1显示的结果与预期吻合.电泳与序列分析结果显示N58DNA已克隆至质粒pET-3c且连接部分的序列正确.2.3sds-东南角分析将重组质粒pET-N58转化E.coliBL21(DE3)后获得的转化子E.coliBL21(DE3,pET-N58)在2×YT培养液培养至A600约为0.5时加IPTG诱导,表达产物进行SDS.图4结果显示,经IPTG诱导6h后,E.coliBL21(DE3,pET-N58)泳道上在6.2ku附近出现一条新的蛋白质带,而未经诱导的BL21(DE3,pET-N58)和经诱导的BL21(DE3,pET-3c)泳道上不出现相应的带.用薄层激光扫描仪进行扫描分析,估算出N58的表达量约占菌体总蛋白的35.4%.SDS结果还显示,菌体经超声破碎后,目标蛋白主要集中在沉淀部分,以包涵体的形式存在.2.4超滤浓缩法分离目标蛋白超声破菌后收集的包涵体经洗涤液Ⅰ,Ⅱ反复洗涤后,溶解于8mol/L尿素中,然后稀释于20倍体积的复性液中复性,得到的复性产物经超滤浓缩后,上SephadexG75层析柱纯化蛋白质样品.经纯化后的目标蛋白纯度达到91.5%(图5).2.5重组n54蛋白对血管内皮细胞生长的影响本实验用50mg/L和0.5mg/L的重组N58蛋白作用于人脐静脉内皮细胞(ECV304)及B16黑色素瘤细胞、人胚肺成纤维细胞HLF和人乳腺癌细胞MCF-7等3种非内皮细胞,用MTT比色法测定A570,并计算抑制率.图6结果显示0.5mg/L浓度的重组N58蛋白即能抑制人脐静脉内皮细胞(ECV304)的生长.抑制率为74.28%,50mg/L浓度时抑制率上升至85.52%.而重组N58蛋白对3种非内皮细胞的抑制率都很低.可见重组N58蛋白能专一地抑制血管内皮细胞的增殖,而对非内皮细胞的生长没有明显的抑制作用.2.6鸡胚血管稀疏表达产物n65蛋白表达的鸡胚血管稀疏率,鸡胚血管稀疏自由基因型md5蛋白表达对cmp血管初始蛋白表达的影响,总蛋白n65蛋白表达的蛋白表达按1.2.6的方法测定N58蛋白的抗血管生成作用,从图7可见,经N58蛋白处理的实验组鸡胚血管稀疏,与对照组比较分支明显减少,说明表达产物N58蛋白具有抑制CAM血管生成的作用.2.7天后平均瘤体积、瘤体重的变化按1.2.7的方法进行抑瘤活性分析,图8及表1的结果显示,注射PBS的对照组小鼠黑色素瘤迅速生长,8天后平均瘤体积达到(1970±546)mm3,而经重组N58蛋白处理的试验小鼠黑色素瘤生长受到抑制,其平均瘤体积仅为(470±90)mm3(P<0.05).将小鼠处死,剥下瘤体称重,发现对照组小鼠平均瘤体重为(1.720±0.49)g,实验组平均瘤体重为(0.56±0.12)g,抑瘤率为71.4%.3n65蛋白在肿瘤治疗中的作用本文应用PCR技术扩增编码钙网蛋白N端第122～180位氨基酸(N58)的DNA片段,实现了其在大肠杆菌中的高效表达,表达产物在体外能抑制内皮细胞的增殖,在体内抑制新生血管的生成,并能阻止实验性肿瘤的生长.N58蛋白的这些生物学活性与Pike等报道的N端第1～180位氨基酸片段的生物学活性相似.如本文用100μg/d剂量的N58蛋白样品,与Pike等用100μg/d剂量的N端第1～180位氨基酸片段样品处理荷瘤小鼠其抑制肿瘤的效果相似.钙网蛋白的抗血管生成活性区是否就在122～180位氨基酸片段或更小的片段,正在进一步研究中.与已发现的血管生成抑制因子,如Angiostatin、Endostatin、Restin、Arestin等相比,N58蛋白是一个很小的的可溶性分子,它的分子质量只有6ku左右,是迄今已报道的最小血管生成抑制因子,而且生物活性稳定,易于重组蛋白的制备和药物的传输.另外,本研究用100μg/d相当于5mg/(kg·d)的剂量处理实验小鼠就能有效抑