中医证候动物模型评价方法的研究

中医证候动物模型评价方法的研究

动物模型的研究需要规范化。这是确保中医现代化研究结果的可靠性、重复性、创新性、准确性和科学性的基本前提。模型评价体系是造模过程中必须有的、应反复进行的一个内容。目前国内仅采用症状、体征的定性法来衡量模型是否成立,其弊端日益明显。且证候模型的指标往往局限于从一个或几个证候本身所表现出的现象中去选择,忽略了疾病对机体整体的影响,这样选择的指标不能全面地反映机体疾病的状态。因此我们必须制定严格科学的动物模型判定标准,使评定标准体系规范化,真正做到指标量化、客观化,宏(观)微(观)结合。代谢组学从整体观出发,以机体代谢物组变化为载体,以时空动态性和全局性观点,试图全面的解析疾病对机体的影响。同时可通过对生物体液和组织中随时间改变的代谢物进行检测、确定、定量和分类,将这些代谢信息与病理生理过程中的生物学事件关联起来,以监测活细胞中的化学变化。本课题组即借助前期宏观体征及以药测证等方法初步明确建立模型成功后,进一步利用代谢组学方法,对样品代谢物进行快速扫描、定性表征和分类,检测和量化一个生物整体代谢随时间变化的规律;建立内在和外在因素影响下,代谢整体的变化轨迹,反映某种病理过程中所发生的一系列生物事件,探讨代谢组学在中医证候动物模型评价研究中的应用。1实验设备和材料1.1外来电气质谱条件美国WatersAcquityTMUPLC液相色谱仪(四元梯度泵-在线真空脱气机-自动进样器-二极管阵列检测器-柱温箱);美国MicromassQ-TOFmicroTM四极杆-飞行时间质谱(电喷雾离子源-正、负离子扫描方法-Lockspray);MassLynxV4.1工作站;电子数字式温度计MC-612型(欧姆龙有限公司);电子天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司);KQ-50B超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司);超净工作台(北京东联哈尔仪器制造有限公司)。1.2酚类分析结果乙腈为色谱级,美国天地公司;娃哈哈纯净水,再经本室Milli-Q纯水机制备;甲酸色谱级,美国霍尼韦尔公司;脑啡肽,Sigma公司;甲醇分析级;异丙醇分析级;氢氧化钠分析级;2,4-二硝基苯酚分析级,上海华东师范大学化工厂。2,4-二硝基苯酚-氢氧化钠溶液制备:精密称取2,4-二硝基苯酚125mg,置于40ml生理盐水中,滴加5mol·L-1的NaOH溶液,不断搅拌,待药液澄明变为亮黄色,再加入生理盐水至50ml。1.3标准饲料和饮用水Wistar大鼠,♂,清洁级,体重为(200±20)g(北京维通利华实验动物技术有限公司提供),大鼠于室内保持12h光照,12h避光循环饲养,给予标准饲料和饮用水,且控制室内温度为(22±1)℃、相对湿度在40%左右。2实验方法2.1大鼠会计时期测量取Wistar大鼠,♂,适应环境3d后,放入代谢笼中适应5d,以MC-612型电子数字式体温计测定大鼠肛温,每日早晚测量体温,连续3d,选取基础肛温在38.0~39.5℃,波动在0.5℃以内者纳入实验,随机分为空白组和模型组。造模前3d,每日早晚测量大鼠的肛温,取其平均值作为正常基础体温;应用2,4-二硝基苯酚造模,皮下注射2,4-二硝基苯酚25mg·kg-1大鼠体重,于造模后1、2、3、4、5h各测体温1次,以给药前大鼠体温平均值为基数,计算各测定时间点体温变化,以各时间点最高体温差(△t)作t检验。用平均体温反应曲线和最大体温上升高度△T作为发热反应的指标。同时于造模前3天用代谢笼收集24h尿液,每日上午8点收集1次,连续3d,尿液置于冰中保存;于2,4-二硝基苯酚造模后1、3、7、13、19h,收集各不同时间点的尿液1次,共收集5次,尿液置于冰中保存,尿液样品于4℃,13000r·min-1离心10min,取上清液过0.22μm微孔滤膜,供UPLC-Q-TOF/MS分析。2.2分析条件2.2.1柱温度1.10色谱柱:ACQUITYUPLCTMBEHC18column(50mm×2.1mmid,1.7μm,WatersCorp,Milford,USA);流速0.40ml·min-1;柱温:25℃;流动相:A:0.1%甲酸-水溶液,流动相B:0.1%甲酸-乙腈溶液;梯度洗脱程序(见Tab1)。二极管阵列检测器全波长扫描,紫外检测器流出液不经分流直接导入质谱系统检测。2.2.2测定条件及检测方法电喷雾离子源(ESI),采用正负离子扫描检测;毛细管电压正离子扫描为3000V,负离子扫描为2800V;样本锥孔电压为35V;分离锥孔电压为3.0V;离子源温度为110℃;脱溶剂温度为300℃;脱溶剂气流量正离子扫描为600L·h-1,负离子扫描为500L·h-1;锥孔气流量为100L·h-1;碰撞能为3V,碰撞气为氩气,微通道板电压为2450V,碰撞室压力小于2.8×10-3mbar;每0.1s采集一次谱图,每次采集0.48s;准确质量校正采用亮氨酸-脑啡肽(leucine-enkephalin,[M+H]+556.2771;[M-H]-=554.2615)溶液,校正溶液进样速度为100μl·min-1,校正频率为5s;扫描方式为全扫描,质量扫描范围m/z100~900。2.3基于平台的降维分析数据采集、原始数据前处理以及数据处理是代谢组学研究中非常重要的一部分,也是研究是否能顺利进行的关键。通过现代化学信息学和生物统计学领域的新方法对获得的多维复杂数据进行降维和信息挖掘,是目前代谢组学研究中进行海量数据处理的研究方向。本课题组采用MicromassMarkerLynx软件进行色谱峰识别以及峰匹配,并采用主成分分析法(PCA)对获得的多维复杂数据进行降维处理。通过对空白对照组及模型组大鼠尿液的代谢指纹数据及模型组不同时间段尿液的代谢组进行分析,绘制出反映组间离散程度的Scoreplot,最终得出实验结果。3结果与讨论3.1大鼠体温变化造模过程中观察到大鼠出现精神萎糜、摄食量减少、摄水量减少、排尿减少、足趾色红等一般情况的变化,自主活动减少,体温升高,呼吸、心率加快等基础指标的改变。以上大鼠造模过程中出现的一系列变化和人类发热过程中的症状和体征改变较相似。通过监测大鼠热病证候模型造模过程中体温变化,记录每只鼠各时间点体温值,以各时间点平均最高体温差(△t)作t检验。实验结果表明,大鼠体温在造模后1h达到最高峰,造模后3h恢复正常。在造模后1~2h过程中,模型组与空白对照组比较P<0.05,差异有显著性。3.2质谱条件优化本实验用色谱柱采用1.7μm填料使得UPLC在较高的线速度下依然可以保持良好的分离效率,为节省分析时间及考虑到质谱系统对流量的耐受性,故采用0.40ml·min-1的流速能够满足分离要求并提高分析通量,同时可不经分流将流出液直接导入质谱系统进行检测。对于尿液这种复杂的生物样本,梯度洗脱是一种较为理想的选择。质谱条件中脱溶剂气流量以及温度对代谢物的离子化效率有较大影响,故优化检测条件时重点考察这两个参数。在优化后的分析条件下,应用此条件取得了良好的分析效果(Fig1)。3.3皮下注射给予2,4-二硝基苯酚后ld-pb疾病病理过程中代谢网络的某些环节出现紊乱,该过程使生物代谢网络、使细胞产生的内源性产物的种类、浓度、相对比例发生扰动,这种扰动体现在小分子代谢产物集合轮廓的改变。因此通过比较正常组与模型组的代谢产物集合轮廓,可以从中得出两者内源性产物种类、浓度、相对比例是否处于相同范围,进而推断造模是否成功。对得分图(Fig2)进行分析可知,大鼠皮下注射给予2,4-二硝基苯酚后尿液代谢物组发生了明显的变化,与空白组相比明显被分类。给予造模剂后大鼠尿液代谢物组发生变化且被明显分为两类,说明给予2,4-二硝基苯酚后大鼠正常生理代谢被干扰,从代谢物组变化的角度可证明2,4-二硝基苯酚诱导热病证候模型造模成功。3.4造模前后内源性代谢产物的变化通过代谢产物整体的变化轨迹,可反映某种病理过程中所发生的一系列生物事件。从下面得分图(Fig3)中可以看到,模型组随着造模后所处时间段的不同,其代谢产物发生了一定的变化。在造模后0~3h,内源性产物的种类、浓度和相对比例发生扰动,在逐渐远离空白组,分类趋势越加明显,在3h达到最大值;在造模后3~19h,内源性产物的种类、浓度和相对比例在逐渐回调至空白组位置,这与热病证候模型造模过程中体温变化趋势相吻合,可佐证本次实验造模成功。4代谢组学及生物组织学特点本课题组前期实验结果表明,2,4-二硝基苯酚(25mg·kg-1大鼠体重)诱导的热病证候模型可持续发热约3h,是短程热病证候模型的代表造模试剂,此造模方法可作为复制热病证候模型的可靠方法。本文中通过对热病证候模型大鼠尿液的代谢组学研究,从机体内源性代谢产物变化角度,对2,4-二硝基苯酚复制的热病证候模型进行了微观水平的评价。从主成分分析结果可以看到此方法灵敏快捷地捕捉到了病理过程中小分子代谢产物集合轮廓的改变,给予造模剂后大鼠尿液代谢物组发生变化且被明显分为两类,从代谢物组变化的角度证明了2,4-二硝基苯酚诱导热病证候模型造模成功,因此代谢组学可用于动物模型评价方法研究。同时从结果中又产生了新的认识:大鼠宏观体征在造模后3h左右就能恢复正常,而机体内小分子代谢产物在造模后19h左右才能接近正常水平,这说明机体内源性物质变化是滞后于宏观体征变化的,因而我们利用代谢组学方法印证了在疾病的治疗中将治疗时间延长到症状恢复后的正确性及必要性。从整体观念来看,证候是由外源性刺激(外邪)或基因变异(内因)所致的病理变化过程,该过程使生物代谢网络和细胞产生的内源性产物的种类、浓度、相对比例发生扰动,这种扰动体现在小分子代谢产物集合轮廓的改变。代谢组学技术最能揭示证候的系统化、动态化、整体化的特点,同