绵羊mhc区drb1基因生物信息学分析

绵羊mhc区drb1基因生物信息学分析

主要组织的兼容配合体（mhs）是由紧密连接的高多态基因座组成的染色体遗传区域。绵羊的MHC基因(OvineLymphocyteAntigen,OLA)位于20号染色体上,分为Ⅰ区、Ⅱ区和Ⅲ区,DRB1基因位于MHC基因复合体第Ⅱ区DR家族B类基因座上,具有丰富的多态性,并且OLAⅡ区在免疫应答中起重要的调控作用。本研究利用生物信息学方法对OLA-DRB1基因及其编码产物的理化性质、序列特征、蛋白质结构以及生物学功能进行预测和分析,有助于从分子水平上理解MHC-DRB1基本结构和生物学功能。同时,通过与其他哺乳动物的DRB1编码产物进行系统进化分析,有助于比较不同哺乳动物DRB1的差异和进化关系,为进一步开展深入研究提供参考。1材料和方法1.1drb1序列数据资料来源于NCBI网站的GenBank数据库,包括绵羊(EU176819)、山羊(BAA23105)、欧洲牛(CAD32254)、羚羊(AAL57171)、亚洲水牛(AAZ765-44)、塔尔羊(AAL57172)、麝牛(AAK67170)、家犬(AAA91187)、猪(AAM55507)、马(NP_001136287)、猕猴(CAE53059)和人类(AAX63463)的DRB1序列。括号内为GenBank登录号。1.2数据分析预测OLA-DRB1基因开放阅读框采用NCBI的ORFFinder程序分析;DRB1编码产物的理化性质采用Bioedit及DNAStar分析软件预测;疏水性/亲水性采用ProtScale预测;蛋白信号肽采用SignalP预测;亚细胞定位采用PSORTⅡ预测;二级结构采用Antheprot分析软件预测;结构功能域及功能分类采用ProtFun预测;多序列比对及同源性分析采用BLASTp程序及MegAlign软件分析。2结果与分析2.1orf识别开放阅读框是基因序列的一部分,包含一段可以编码蛋白的碱基序列,不能被终止子打断。DNA序列可以按6种框架阅读和翻译(每条链3种,对应3种不同的起始密码子)。ORF识别包括检测这6个阅读框架,并决定哪一个包含以启动子和终止子为界限的DNA序列而其内部不包含启动子或密码子,符合这些条件的序列有可能对应一个真正的单一的基因产物。ORF的识别是证明一个新的DNA序列为特定的蛋白质编码基因的部分或全部的先决条件。本研究采用NCBI的ORFFinder程序,参照Kozak法则,寻找出一条长801bp的ORF(图1),起始密码子位于1bp,终止密码子位于801bp,推测编码266个氨基酸残基。2.2drb1基因生物酶活性预测蛋白质的基本性质包括其相对分子质量、氨基酸组成和等电点等。用Bioedit及DNAStar分析软件对绵羊DRB1基因编码产物的理化性质进行预测,DRB1基因的氨基酸组成见图2。DRB1基因编码266个氨基酸,组成中最多的两种氨基酸是Leu(亮氨酸)和Arg(精氨酸),所占比例分别达到8.65%和8.27%。负电荷残基总数(Asp+Glu)为27,正电荷残基总数(Arg+Lys)为29,在pH7.0环境下其电荷量偏低,为3.122。其理论分子量约为30.43kD,理论等电点为8.086。2.3drb1蛋白疏水性及亲水性分析瑞士生物信息学研究所的Protscale是一款预测分析疏水性/亲水性的分析软件。用DNAStar分析软件对DRB1基因编码产物的疏水性/亲水性进行预测,其疏水性平均系数为0.337,参照ExPASy的Protscale程序计算DRB1编码产物的疏水性/亲水性图谱(图3)。分析氨基残基的得分可知,多肽链的第239位的亮氨酸(Leu)具有最高的分值3.089,疏水性最强;第159位的精氨酸(Arg)具有最低的分值-2.356,亲水性最强。整条多肽链表现为亲水性,因此可推断绵羊DRB1是一种可溶性蛋白。编码产物的疏水性结果2.4drb1基因编码产物的分析蛋白质的定位是通过信号序列引导实现的。信号序列通常为15-60个氨基酸长度,位于新生肽的N端。信号序列根据运输方向的不同分为3种类型,即入核信号、引导肽和信号肽,其中信号肽指导内膜系统的蛋白质运输,且在完成蛋白质定位后被切下。本研究采用丹麦Tekniske大学生物学序列分析中心提供的在线蛋白质序列信号肽分析工具SignalPV2.0.b2对DRB1基因编码产物进行了分析。在线输入DRB1基因编码产物的前70个氨基酸序列,程序分别自动利用神经网络模型(NN)和隐马尔可夫模型(HMM)进行信号肽分析,并给出了3种C、Y、S-score计算结果。对于一个典型的信号肽,C值和Y值趋向于+1,S值在剪切位点之前高而在剪切位点之后变低。神经网络模型(NN)预测的信号肽结果如图4所示,隐马尔可夫模型(HMM)预测的信号肽结果如图5所示。绵羊DRB1编码产物的分值曲线非常典型,C值为0.989,Y值为0.931,S值为0.984,其切割点位于29-30位的氨基酸之间,基本可以判定DRB1编码产物存在信号肽。2.5drb1编码产物的亚细胞定位亚细胞定位的预测一般通过算法比较查询序列中所包含的特征参数与各类相应的亚细胞定位的相似度,然后以一组概率值的形式作出判断。通过工具PSORTⅡ预测DRB1编码产物的亚细胞定位,从分析结果(表1)可知,其分布在内质网的可能性为44.4%,分布在高尔基体的可能性为33.3%,分布在质膜的可能性为22.2%。因此可以推断,绵羊DRB1编码产物主要在细胞质中发挥生物学作用。2.6drb1编码产物的二级结构及编码产物的性质预测二级结构主要指多肽链依赖氢键排列成在一维方向上具有周期性结构的构象,对其进行预测与分析有助于认识蛋白的空间结构,采用Antheprot4.5分析软件预测DRB1编码产物的二级结构,分析结果如图6和表2所示,绵羊DRB1编码产物是由20%α-螺旋(Helix),22%延伸链(Sheet),15%β-转角(Turn),43%无规则卷曲(Coil)组成。由此可推测,无规则卷曲是绵羊DRB1最大量的蛋白质二级结构元件,α-螺旋、延伸链和β-转角则散布于其整个蛋白质中。2.7drb1编码产物的功能预测丹麦技术大学生物学序列分析中心(CBS)的Protfun是一款预测分析蛋白结构功能域及功能分类的分析软件。本研究通过Protfun分析软件预测DRB1编码产物的功能,从分析结果(表3)可知,该蛋白具有免疫应答(Immuneresponse)、受体(Receptor)、胁迫应答(Stressresponse)和信号转导(Signaltransducer)功能的可能性分别为3.211、3.020、2.063、1.678,DRB1可能在免疫应答和胁迫应答过程中发挥重要作用,可能对绵羊免疫力和抗病性起关键作用。2.8drb1编码产物的同源分析BLAST是一套在蛋白质数据库或DNA数据库中进行相似性比较的分析工具。BLAST程序能迅速与公开数据库进行相似性序列比较。BLAST结果中的得分是一种对相似性的统计说明。将绵羊DRB1编码产物序列输入至Blastp,搜索Swiss-Prot数据库,进行同源蛋白搜索与比较。图7可以看出,DRB1几乎在所有的哺乳动物中都有表达,且与山羊、羚羊和牛等物种的蛋白同源性最高,高达90%以上,这也说明了它们在进化过程的亲缘关系。通过从相关数据库中收集下载各物种DRB1编码产物的资料,本研究构建了12个物种的DRB1系统发育树(图8)。从图8可以看出,绵羊DRB1编码产物与山羊、羚羊、塔尔羊和牛等物种上具有高度同源性,在系统发育树中距离最近。另外在其他一些物种上DRB1也具有极高的同源性,而且它们都有非常相近的生物学功能。3os4编码产物的同源性在脊椎动物中MHC是被广泛、深入研究的一个基因区域。MHC是基因组中多态性最丰富的区域,对MHC遗传变异分析可以提供物种的遗传多样性信息,因而具有重要的生物学意义。MHC的基因产物称为MHC分子,是一类表达于细胞表面的脂蛋白,MHC分子主要与外来抗原相结合并将这些抗原递呈给T淋巴细胞,最终引起机体的免疫反应,因此,在脊椎动物的免疫系统中起着重要的作用。本研究通过蛋白质的亚细胞定位、信号肽、疏水性预测,分析OLA-DRB1基因编码蛋白功能。并且通过进化比对,发现绵羊DRB1基因与山羊、羚羊和牛的DRB1基因的分子进化距离最近,亲缘关系最为密切。这与动物学分类结果一致,这种同源性在一定程度上代表着物种亲缘关系的远近,同时也反映了DRB1编码产物在不同物种结构上的稳定性对生物体的功能重要性。从分析结果中可知,OLA-DRB1编码产物由266个氨基酸组成,平均疏水系数为0.337,整条多肽链表现为亲水性,说明该蛋白质的亲水性较好,为水溶性蛋白,其二级结构很容易接近水分子,OLA-DRB1编码产物二级结构主要是以无规则卷曲和延伸链为主,主要在细胞质中发挥生物学作用,并且预测出信号肽的剪切位点位于29-30位的氨基酸之间,已知信号肽位于分泌蛋白的N端,它对于外分泌蛋白的分泌起主导作用。Antonio等发现,改造了的信号肽可大大提高外源蛋白表达量。因此,在我们预测的信号肽位置进行修饰,可以提高编码蛋白在绵羊体内的表达。功能分析预测该蛋白具有免疫应答、受体、胁迫应答和信号转导等功能,可能对绵羊免疫力和抗病性起关键作用。通过序列的相似性检索得到许多相关的相似序列,将这些相似序列做一个总体的比对从而观察它们在序列结构上的异同。本研究利用Blastp方法在蛋白数据库中对DRB1编码产物进行同源比对,结果发现,DRB1编码产物的氨基酸序列与山羊、羚羊、塔尔羊和牛的DRB1蛋白序列具有较高的同源性。使用蛋白质序列进行后续分析更能够发现该研究对象的生物学意义,因为蛋白质水平之间具有25%的同源性就可提示其功能的相似性