基于近红外光谱的蜂蜜中果糖、葡萄糖、蔗糖和蔗糖含量测定

基于近红外光谱的蜂蜜中果糖、葡萄糖、蔗糖和蔗糖含量测定

葡萄糖、葡萄糖、葡萄糖和葡萄糖是蜂蜜中含量最高的四种养分。这些糖在蜂蜜的营养效果和结晶状态中起着重要作用。检测这些成分,通过其比例的变化,可以判定蜂蜜是否掺假。当前针对糖类的传统检测方法存在成本高,污染环境,检测要求技术水平高等缺点。近红外光谱分析技术具有高效、快速、成本低、不破坏样品化学性质和绿色环保等优点,该技术用于蜂蜜理化指标的测定以及掺假和蜜源植物的判别已有较多报道。将其用于蜂蜜成分检测和在线实时监控,具有传统测量方法不可比拟的优点。本文在前人研究的基础上,探索近红外光谱在蜂蜜成分检测中的光谱前处理方法、奇异样本剔除法、光谱数据压缩和校正模型的建立方法。通过比较这些方法,选择适合的化学计量学方法,从而提高模型的预测精确性和泛化能力。1材料和方法1.1非成品蜜样品的配制蜂蜜样品由湖南省明园蜂业有限公司提供,分别由厂方采自湖南、山西、陕西、广西、广东、宁夏、浙江、湖北、江西、四川10个省。其包括荆条蜜、苹果蜜、柑橘蜜、桂圆蜜、油菜蜜、洋槐蜜、荔枝蜜、益母草蜜、黄芪蜜、枸杞蜜、九龙藤蜜、枣花蜜、野菊花蜜、山桂花蜜、老瓜头蜜、紫云英蜜和雪脂莲蜜共计17个品种,包含经加工的商品蜜和直接由蜂农采集的非成品蜜。为提高模型的适应性,在试验室调配了果葡糖浆掺假6个样品和麦芽糖浆掺假6个样品。整个试验共计135个样品。其中样本集分为两部分,校正集100个样品,验证集35个样品。试验用样品在测定前先经50℃水浴溶解其中的结晶,之后置25℃室温下静置过夜后采集光谱。果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖标准物质(纯度≥99%),乙腈(色谱纯),一级水,符合GB/T6682规定。1.2反射器AntarisⅡ型傅里叶变换近红外光谱仪,配备丹麦FOSS公司浆体杯(slurrycup)、镀金反射器(goldreflector),美国ThermoScientific公司;高效液相色谱仪(LC-20AT),配有示差折光检测器(岛津RID-10A),日本岛津。1.3光谱测定样品采用傅里叶变换近红外光谱仪,积分球和旋转台测定样品漫反射光谱,配备浆体杯、镀金反射器。将样品置于浆体杯中,用镀金反射器压实,注意避免气泡压入其中。采用透反射积分球模式采集光谱,扫描32次,分辨率8cm-1,透反射光程0.1mm,光谱测定范围4000~10000cm-1。每个样本重复测定3次,取平均值作为样本的原始光谱。1.4标准工作曲线的绘制将蜂蜜样品净水溶解后用乙腈定容,通过0.45μm滤膜过滤,采用液相色谱示差折光检测器测定。通过外标法定量。果糖、葡萄糖标准储备溶液配制方法:于同一100mL容量瓶中称取0.5g果糖标准物质和0.4g葡萄糖标准物质(精确至0.0001g),之后加入60mL水溶液,用乙腈定容至刻度,摇匀。蔗糖、麦芽糖标准储备液配制方法:于同一100mL容量瓶中分别称取0.2g蔗糖和0.2g麦芽糖标准物质(精确至0.0001g),加入60mL水溶液,用乙腈定容至刻度,摇匀。果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖标准工作液配制方法:吸取不同体积的果糖、葡萄糖标准储备溶液和蔗糖、麦芽糖储备液,用乙腈-水(体积比40∶60)溶液稀释(乙腈-水溶液使用前配好,并用超声混合均匀)。配制不同浓度的果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖标准工作溶液,用于绘制回归标准工作曲线。每种标准储备溶液的用量和定容体积见表1。液相色谱条件:色谱柱:LichrospherNH2柱(10nm×5μm,4.6mm×250mm,江苏汉邦);流动相:乙腈-水(体积比77∶23);流速:1.0mL/min;柱温:30℃;检测器池温度:35℃;进样量:15μL。以检测器获取峰高为纵坐标,工作溶液浓度为横坐标绘制标准工作曲线,确保样品溶液中果糖、葡萄糖、蔗糖和麦芽糖的响应值均在工作曲线范围,以保证标准曲线符合线性规律。样品溶液与标准工作溶液等体积进样,测定。按照以上步骤,对同一试样做2次平行测定。式中,X———试样中被测组分含量,单位g/100g;c———从标准工作曲线上得到的被测组分溶液的质量浓度,单位g/100mL;v———样品溶液定容体积,单位mL;m———试样质量,单位g。1.5偏最小二乘法平滑(smoothing)算法,导数算法(derivative),多元散射校正(multiplicativescattercorrection,MSC),小波变换(wavelettransform,WT),偏最小二乘法(partialleastsquares,PLS)[11,12,13,14,15,16]。校正模型评价参数包括交叉验证均方根误差(RMSECV)、相关系数(R)、预测残差平方和(PRESS)及预测均方根误差(RMSEP)。2结果与分析2.1计算距离和预测集的方法K-S(Kennard-Stone)法是根据被选择的样品计算未被选择样品的最小欧式距离,随后通过计算出来的欧氏距离,选择欧氏距离最大的样品进入校正集,反复行这一步骤,直至选出指定的样品数。K-S算法具体步骤是:(1)首先计算两两样本之间的距离,选择距离最大的2个样品;(2)分别计算剩余样本与已选择的2个样本之间的距离;(3)对于每个剩余样本而言,其与已选样品之间的最短距离被选择,然后选择这些最短距离中相对最长的距离所对应的样本,作为第3个样品;(4)重复步骤(3),直至所选样品的个数等于事先确定的数目为止。本研究中共120个样本,通过K-S法挑选出90个样本作为校正集,余下的30个样本作为预测集。图1显示采用K-S法挑选出的90个样本的第一主成分和第二主成分得分图。可以看出预测集样本包括在校正集样本的分布空间中,校正集样本在主成分上分布均匀。此校正集样本具有代表性。预测集样品的光谱信息包括在校正集样本的光谱信息中。通过这样的划分能够提高预测模型的精度和泛化能力。2.2光谱预处理对模型的影响选用平滑处理(smoothing)、一阶导数(firstderivative)、二阶导数(secondderivative)、多元散射校正(MSC)4种预处理方法对选择波段后的光谱进行预处理,增强与成分含量相关的光谱吸收信息,消除样品间散射影响所致基线平移和偏移现象,提高原吸光度光谱的信噪比,尽可能地去除无关信息变量。这里的PLS因子数等同于主成分分析中的主成分数。以果糖为例,未经预处理的光谱选择的PLS因子数较多,其原因是光谱中包含较多的噪声信息。通过平滑、求导和多元散射校正后,选择较少的PLS因子数,采用原始光谱建立模型,选取16个主成分。最终建立模型的交互验证均方差为0.629,Q2达0.971。从模型评价的角度看,该模型已具备了较高的预测精确度。多元散射校正后,用校正的光谱建立模型,选取主成分数仅13个。较少的主成分数能够加快模型的运算速度,有利于提高模型的稳定性,其交叉验证均方差为0.625。虽然这一精度变化不明显,但仍可以认定经光谱处理的模型总体评价优于未处理光谱建立的模型。从表2可以看出,对于果糖和麦芽糖,导数处理没有提高模型的预测能力,可能是因为在求导过程中,虽然扣除了有限的基线平移和偏移现象,但放大了噪声,降低了信噪比;而在葡萄糖和蔗糖的处理中,多元散射校正没有起到明显的作用,主要是由于MSC假定散射波长及样品浓度无关,因此当分析组分性质变化较小的样品时,MSC校正结果并不理想。蜂蜜是一种均匀的粘稠液体,没有颗粒度大小等因素的影响,即便是其粘稠度会造成一定程度的基线漂移,也不会影响模型的精确度。通过比较4种糖的预处理方法,结果并非光谱预处理做的越多获得的模型预测能力越好。过多的光谱预处理反而会在处理中删除有用的光谱信息,导致预测能力下降。2.3蒙特卡罗交互验证法奇异值的识别是多元校正研究的热点问题。这些诊断方法通常是单个奇异样本的识别,如马氏距离判别法、光谱残差的检验、杠杆值和学生t检验等。稳健回归,如MVT(MultivariateTrimming)和MCD(MinimumCovarianceDeterminant)等可以识别多个奇异样本,但重点是识别光谱方向的奇异点。2009年提出的基于蒙特卡罗交互验证的奇异值检测方法,考虑了光谱阵、性质阵和模型方向奇异点对模型稳健性的影响,能够同时识别3个方向的奇异点,以此降低掩蔽效应带来的影响,与以上方法相比表现出更高的奇异样本识别能力。本文采用蒙特卡罗交互验证法检验奇异值,步骤是:首先利用PCR确定最佳主成分数,之后将数据随机分为两部分,即训练集和验证集。训练集是通过PCR确定的主成分数建立校正模型,验证集则用来预测样本的预测误差,反复循环多次以保证每个样本都被检测到。从以上步骤获得每个样本的预测误差分布,计算每个样本的预测残差的均值和标准偏差。对样本的均值和标准偏差作图,那些高均值和高标准偏差区域的样本往往被认定为奇异样本。蜂蜜作为一种复杂的混合物,成分繁多,每种蜂蜜的特定成分有所差异。本研究中采集的蜂蜜来源广泛,多数为直接来自蜂农采收的原蜂蜜。这些蜂蜜样本个体往往存在个别组分的差异,比如总样本中92号样本水分含量远高于其它样本含量。当个别样本的性质范围远远超出校正集样本范围时,如果仍然在模型建立中使用该样本,就会使模型出现较大的偏差,不能够准确预测未知样本。在建立校正模型之前,检测并剔除掉奇异样本是获得一个稳定模型的关键。从表3可以看出,扣除这几个奇异值后,模型的交互验证均方差和交互验证决定系数都有不同程度的提高,麦芽糖模型的预测精确度从不能接受到可以接受。总之,果糖、葡萄糖、蔗糖和麦芽糖的模型质量都有了提高。2.4小波变换前后的建模小波滤噪是对信号和噪声的小波变换系数进行处理,根据信号和噪声在不同尺度上小波变换的不同形态表现,构造出相应的规则。其处理的实质是最大限度地保留有效信号对应的小波系数,小波变换前后预测结果并没有因为大量变量的剔除而发生明显的变化。通过小波压缩,建模由1557个变量降至几十个变量,大大缩短建立模型同时减小甚至完全剔除由噪声产生的系数。经多次筛选和比较,参考相关文献和多次试验研究,小波滤噪参数选择是:用Birge-Massart策略来确定各尺度的阈值,小波基采用db7,用5尺度分解。及通过模型预测蜂蜜中糖含量所需的运算时间,有效提高了检测效率。2.5糖的预测结果对比对每个样品都采用透反射的光谱采集方式,并用外部验证的方法评测模型预测能力。首先用表2中的前处理方法对数据处理,通过蒙特卡罗交互验证方法扣除奇异值后,用K-S法划分训练集和预测集,最后建立PLS校正模型,见表6。果糖、葡萄糖和蔗糖的交互验证决定系数均在0.94以上,预测误差都较小,预测效果良好。只有麦芽糖的预测能力较差,可能是因为蜂蜜中麦芽糖含量较低,影响近红外光谱的预测能力。这些指标的预测结果与传统的化学方法测定值之间的相关性见图8。果糖、葡萄糖、蔗糖和麦芽糖的预测结果与真实结果的决定系数R2分别为0.967,0.923,0.958和0.738,表示其相关性。从数值来看,与交互验证决定系数相近,能够反映模型的精确性和准确性。近红外预测值可以准确地逼近其真实化学值。表7列出4种糖的真实值与预测值。这些数值说明近红外光谱建立的预测模型,可精确预测蜂蜜中果糖、葡萄糖、蔗糖和麦芽糖含量,其中麦芽糖含量大于1%时其预测能力是能够满足商检需求的。3蜂蜜中不同成分的检测模型采用近红外光谱技术对蜂蜜中果糖、葡萄糖、蔗糖和麦芽糖含量进行研究,结果表明,采用蒙特卡罗交互验证法,剔除奇异值,可有效改善数据分布,提高模型的准确性。本研究涉及十几种蜂蜜,试验模型包含来自多个省份的十几种蜂蜜样品,不同的地理位置和植物来源都会对光谱产生影响,只有在这种复杂的条件下建立模型才有更广的适用范围;试验模型中加入了掺假样品,也是为了使模型更好地适应实际检测的需要。通过上述化学计量学方法得到的蜂蜜中4种糖的近红外光谱模型,准确、可靠。本方法为蜂蜜快速检测和在线实时质量控制提供了依据。下阶段将研究近红外光谱技术在蜂蜜其他成分含量检测中的应用,寻找利于建模的敏感波段,扩充蜂蜜的样本数量,并且进一步优化建模方法。本研究中使用蒙特卡罗交叉验证方法检验奇异点。每次随机抽取80%的样本建立PL