葡萄籽提取液大孔树脂洗脱过程多酚含量的测定

葡萄籽提取液大孔树脂洗脱过程多酚含量的测定

1筛选、纯化和分析方法葡萄籽富含黄酮类、花色糖、原花色素和原花青素等多酚类物质。葡萄籽提取物在食品、医药、化妆品以及保健品等方面应用日益广泛,已被我国卫生部批准为保健品原料。葡萄籽粗提物中含有多糖、蛋白等多种杂质,需要进一步分离纯化。近年来,大孔吸附树脂吸附法常用于葡萄籽或者其他天然植物中的多酚类化合物的富集纯化。在大孔树脂纯化过程中,洗脱液收集的起点和终点的判断对产品的收率及纯度影响较大。实际生产中,常依据经验判断收集起点和终点,或采用离线分析方法,不能准确及时监测目标成分的变化,导致产品质量不高,或批次间差异较大。近红外光谱法主要反映有机物分子中CH,NH和OH等含氢集团的倍频与合频振动,与多酚类物质的常规定量检测方法(比色法和高效液相法)相比,基本无需样品前处理,适用于生产过程在线监测分析。本研究采用近红外光谱技术监测大孔树脂纯化过程中葡萄籽多酚含量动态变化,以实现生产过程在线检测。2实验部分2.1仪器和设备ANTARIS近红外光谱仪(美国Thermo公司),配液体透射检测器,2mm内径石英比色皿;TU-1810紫外-可见分光光度计(北京普析通用仪器有限公司);DK-S24电热恒温水浴锅(上海精宏实验设备有限公司);FA2004电子天平(上海越平科学仪器公司)。葡萄籽(浙江天鼎有限公司);福林-酚试剂购自中国药品生物制品检定所;没食子酸对照品(纯度≥98%,批号:120563-200412)和AB-8大孔树脂(南开大学化工厂);95%乙醇(药用级)。2.2实验方法2.2.1树脂层的预处理在吸附柱(400mm×25mm)内加入相当于装填树脂体积0.4～0.5倍的95%乙醇,然后将新树脂装入柱中,柱体积为100mL,浸泡24h,用200mL95%乙醇以200mL/h的流速通过树脂层,并浸泡4～5h;用乙醇以200mL/h的流速通过树脂层,洗至流出液加水不呈白色浑浊,并用水以同样流速洗净乙醇。2.2.2柱净化、洗脱等样本的收集取适量葡萄籽,加入6倍量55%乙醇,80℃温浸提取,提取3次,每次45min,滤过,合并提取液,减压回收乙醇至无醇味,加约3倍量45℃的水,室温静置24h,以3000r/min离心15min,取上清液备用。将制备的提取液过大孔树脂柱,先以水洗去杂质,再用40%乙醇以20mL/h的速度洗脱,在洗脱过程中每隔一段时间收集洗脱液样本。4根树脂柱平行操作,每根柱子收集30个样本,共得到120个样本。图1为其中一根树脂洗脱过程多酚浓度变化曲线(Folin-Ciocalteus比色法测定)。2.2.3实验样品和方法采集洗脱过程样品的透射光谱,光谱扫描范围4000～10000cm-1,扫描次数为32次,分辨率为8cm-1,液体样品池为2mm光程的石英比色皿。实验采用空气为参比进行光谱采集,测量时环境温度为20℃,相对湿度为40%。洗脱过程采集的120张样品的原始近红外光谱见图2。2.2.4验证集数据分析在适宜的光谱预处理基础上,选择合适的波段,运用偏最小二乘法(PLS)建立近红外光谱的多元校正模型。以交叉验证误差均方根(RMSECV)为评价指标,对校正集样本考察校正集误差均方根(RMSEC),对验证集样本考察验证集预测误差均方根(RMSEP),同时用校正集和验证集相对偏差(RSEC)和(RSEP)分别考察模型校正集和验证集相对偏差值。所有数据处理采用TQAnalyst7.2软件。2.2.5福林-酚试剂法移取0.104g/L没食子酸对照品液0.2,0.4,0.6,0.8和1.0mL,置10mL容量瓶中,分别加水至约6mL,摇匀,各加入福林-酚试剂0.5mL、15%Na2CO32mL,用水定容至10mL,摇匀,反应2h。以相应试剂为空白,在760nm处测定吸光度。以没食子酸浓度C和吸光度A做回归分析,得到线性回归方程为A=9.52C+0.0610,r=0.9995。根据样品的浓度取0.5或1.0mL用于定量测定。3结果与分析3.1异常光谱的判别由于光谱仪本身的误差,操作误差、波长的漂移和测量环境的变化等原因,可能引起样品近红外光谱出现异常,从而降低模型的精度。本实验采用样品杠杆值、学生残差和样品的马氏距离判别异常光谱。图3为120个样本光谱的马氏距离分布图,样品集马氏距离的平均值为0.94,阈值为1.50,其中最后的8个样本光谱马氏距离超出阈值,视为异常样品。图4有7个样本相对于其它样本较为离群,其对应的杠杆值和学生残差相对值较高。综合结果,5个样本的马氏距离超出阈值,且其杠杆值和学生残差值高,最终将这5个样品剔除。3.2特征信息预处理在近红外透射光谱的采集过程中,温度、湿度等变化会引起光谱基线的偏移。为了有效提取特征信息,需对光谱进行预处理,选出最有效的光谱区域。本研究通过交互验证法比较了不同预处理方法对模型性能的影响。由表1可见,采用Savitzky-Golay二阶导数平滑滤波处理,建模效果比较理想(RMSECV值最小,且模型相关系数也较高)。3.3savitcity-gola常用的模型虽然PLS法允许全光谱信息建模,但如果建模波段过宽,必然包含大量冗余信息,波段选择有利于提高模型预测精度。经过二阶导数和Savitzky-Golay平滑处理后,在7500～6500cm-1,5500～6200cm-1和4200～4600cm-1区间都存在较明显的波段。本实验分别考察了这3个波段以及相互组合对所建模型性能的影响,结果见表2。从表2可见,采用5500～6200cm-1所建模型性能最佳。3.4葡萄籽原花青素总多酚洗脱过程近红外定量校正模型的建立将其中3根柱子的洗脱样品的检测值作为校正集,采用Savitzky-Golay二阶导数平滑处理,在5500～6200cm-1波段范围内,用PLS法建立葡萄籽原花青素总多酚洗脱过程的近红外定量校正模型(见图5a)。从图5a可见,验证集的预测值与比色法测定值之间相关性良好,测量结果趋于一致。校正模型采用9个主因子(见表2),相关系数R2为0.9995,RMSEC为0.713,RSEC为2.39%。3.5外预测值与比色法测定值的相关关系将建立的模型对第4次实验样品中葡萄籽