nk1受体阻滞剂对电针大鼠内关穴抗ami损伤效应的自主神经及中枢sp、nos的影响

nk1受体阻滞剂对电针大鼠内关穴抗ami损伤效应的自主神经及中枢sp、nos的影响

通过相关实验，p物质和氧化氮基因（nos）是电针内关穴抗急性心肌缺血（acutionianacademyclovac细胞（pmi）损伤效应的重要物质。刘强等研究提示心脏和内关穴区的神经纤维有一部分来自脊神经节和迷走神经节中的同一个神经元。这为电针内关穴抗AMI损伤与心自主神经参与提供了有力依据。由于SP广泛分布于心血管中枢,为探讨SP在自主神经及其中枢对电针内关穴抗AMI损伤效应中的作用机制,拟开展本实验。由于NK1受体对SP最敏感,是中枢SP作用的主要受体,NK1受体阻滞剂能透过血脑屏障,因此本实验选择静脉注射NK1受体阻滞剂,观察电针内关穴对AMI大鼠自主神经作用效应及中枢SP、NOS阳性表达,进一步分析SP在内关-心脏相关中的作用。1材料表面1.1实验动物SD大鼠30只,体重180～200g,雌雄不拘,由华中科技大学同济医学院实验动物学部提供,普通级,动物合格证号:610103。1.2聚氨基四氮唑蓝的合成100μL,购自CHENICONINTNATIONAL(AM.);即用型SABC免疫组化染色试剂盒:购自武汉博士德生物公司;NADPHNa4:25mg,购自Biosharp(AM.);3-3-DAB.4HCl(3-3二氨基联苯胺盐酸盐):1g,购自Amresco,由荟萃生物公司提供;氯化硝基四氮唑蓝:250mg,购自科瑞生物公司(上海,英国分装);NK1受体阻滞剂:L-703606,5mg,FW598.5,SIGMA。2方法2.1股静脉采血试验20%乌拉坦给于大鼠腹腔注射麻醉(5mL/kg),按6U/kg比例股静脉注入垂体后叶素(pituitary,Pit)注射液(6U/mL,蚌埠市宏业生化制药厂,批号020612)观察心电图在1min内出现心率明显减慢、T波显著高耸,或ST段抬高>0.1mV为造模成功。2.2神经节的分离交感神经放电记录大鼠麻醉后手术台仰卧固定,颈部剪毛,碘伏消毒,在喉头与胸骨间沿颈正中线作长约2.5～4cm的切口,寻找右侧颈动脉鞘(内有颈动脉及迷走神经)后,分离出迷走神经主干约1～2cm,并以4号线从中间引出备用;在左侧颈总动脉后、椎前肌浅面、椎体旁,将椎前筋膜用玻璃分针纵向剥离,找出颈交感干,沿交感干向下找出颈下神经节,用细线穿过神经下方引出备用。将分离的右侧迷走神经、左侧交感神经分别挂上BL-420E+生理仪(成都,泰盟)银丝电极,记录神经放电情况,记录中石蜡油湿润神经,记录时间25min。2.3小鼠海马的组织病理学检测切片打开大鼠胸腔,经升主动脉插管,先用0.9%Nacl注射液100mL快速灌注,后用4%多聚甲醛的0.1mol/LPBS液(Ph7.4)400mL先快速、后缓慢灌注固定50～60min。灌注完毕立即取完整脑组织及C7～T7段脊髓放入上述相同的新鲜固定液中固定4h,再移入25%蔗糖溶液过夜沉底(4℃),次日取出组织作恒冷箱连续冠状切片,片厚40μm。按大鼠脑定位图谱,留海马出现至海马伞体积最大显示之间切片20张/只;切取延髓第四脑室至中央导水管段留片20张/只;切取脊髓C8～T2段留片20张/只。上述切片0.01mol/LKPBS液4℃保存。2.4sp抗体-igg-sp-100-u切片漂洗(入0.01mol/LKPBS液漂洗10min×3次,下同);浸入80%甲醇双氧水(双氧水浓度为0.3%)30min(4℃),漂洗;入含0.3%TritonX-100的0.01mol/L的KPBS缓冲液摇床30min;入SP抗体(稀释浓度1:1000)4℃孵育48h,漂洗;入生物素化羊抗兔IgG(稀释浓度1:0)4℃孵育12h,漂洗;入SABC复合水(释浓度1:0)4℃孵育12h,漂洗;显色,漂洗;贴片\干燥;脱水;明胶封片。2.5u3000结论切片漂洗;入含0.3%TritonX-100的0.01mol/LKPBS缓冲液摇床30min,漂洗;入孵育液(硝基四氮唑蓝2mg溶入含0.3%TritonX-100的0.01mol/LKPBS液10ml中,抽出1ml加入NADPH1mg,37℃2h),漂洗;贴片\干燥;脱水;明胶封片。2.6神经放电检测SD大鼠30只,随机分为正常组(A组)、模型对照组(B组)、电针内关组(C组)、阻滞剂组(D组)、阻滞剂+电针内关组(E组),每组6只。各组处理方法如下:正常组(A组):分离神经、记录神经放电,分别于第0min、3min、8min、13min、23min标记,之后脊髓、脑固定并取材、切片,检测SP、NOS。模型对照组(B组):分离神经、记录神经放电,第3min造模,分别于造模前、造模后0min、5min、10min、20min标记,之后组织固定、取材、切片、检测同A组。电针内关组(C组):分离神经、记录神经放电,造模、标记同B组,造模后5min针刺左上肢内关穴(参照华兴邦“大鼠穴位图谱”,于尺骨、桡骨缝间离腕关节约3mm处取“内关”穴,毫针0.38mm×15mm)并接G6805-1型电针仪,疏密波(8～80Hz,疏密波转换14次/min,电压1.5V,强度1mA),电针5min后去电针仪继续留针至15min起针。最后组织固定、取材、切片、检测同A组。阻滞剂组(D组):在记录交感神经及迷走神经放电前30min左侧股静脉注入NK1受体阻滞剂(250nmol/kg),其余操作同模型对照组(B组)。阻滞剂+电针内关组(E组):在记录交感神经及迷走神经放电前30min左侧股静脉注入NK1受体阻滞剂(250nmol/kg),其余操作同电针内关组(C组)。2.7免疫组化法测入射光度值观察各组造模前,造模后0、5、10、20min各时刻迷走神经及交感神经放电频率(Hz)。依据国外文献报道,当所记录的峰电位波幅大于基础干扰波波幅2倍以上时,可认为是有效放电,各时刻后1min内10次采样,每次采样时长1s,累加取均值。观测PVN、延髓迷走神经复合区及脊髓外侧角SP、NOS灰度值。运用图像分析系统测定其灰度值是对其免疫组化结果进行量化评价的一种方法,即入射光灰度和它穿过免疫阳性反应产物后的灰度之比的对数值,红光光密度与其含量呈正比,而绿光和蓝光与其含量呈反比。由于SP免疫阳性反应产物呈棕褐色,因此,SP光密度值与其含量呈正比,而NOS免疫阳性反应产物呈蓝色,故NOS光密度与其含量呈反比。3sp、nos免疫阳性基于实验的大鼠血清pn、c8木纳格、c8木马立克氏体免疫阳性sp、c82sp或nos免疫阳性增加值sp、nos免疫阳性增加值sp、nos免疫定量见表1图像分析采用HPIAS-1000高清晰彩色病理图文分析系统进行,对棕黄色和蓝色杂交信号进行灰度扫描。每鼠取下丘脑室旁核(PVN)、延髓迷走神经背核、C8～T2各4张,每片于相应部位取3个视野,每项指标共12个视野,分别测定,累加取均值,即为该鼠SP或NOS免疫阳性灰度值。数据以ˉx±s表示,组内比较、组间比较采用SPSS12.0软件进行方差分析,显著性标准为0.05。4结果4.1肌活检神经放电频率从表1可以看出,造模后各时刻迷走神经放电频率B组与造模前及A组相应时刻相比显示差异性(P<0.05),C组造模后0min与造模前及A组放电频率也显示差异性(P<0.05),均提示心肌缺血造模后引起迷走神经放电频率增加;C组造模后20min(即电针内关结束)迷走神经放电频率降低,与组内造模前及A组同时刻比较无差异,与同时刻B组相比有差异性(P<0.05),提示电针内关穴对急性心肌缺血引起的迷走神经放电有抑制效应。造模前,D、E组与A组放电频率相比,组间无差异;造模后0～20min,D、E组放电频率增加,与A组比较有差异性(P<0.05),提示SP受体阻滞剂对AMI大鼠迷走神经的兴奋未造成明显影响;E与C组在造模后10、20min组间比较有差异性(P<0.05),提示NK1受体阻滞剂影响了电针内关穴对AMI的保护效应。4.2电针内关穴对ami引起的单次入射电特性的影响从表2可以看出,B、C组造模后交感神经放电频率与造模前及A组同时刻相比显示差异性(P<0.05),提示心肌缺血造模后引起交感神经放电频率增加;C组造模后20min(即电针内关结束)交感神经放电频率增加,与组内造模前及A组相应时间段无差异,与同时刻B组相比有差异性(P<0.05),提示电针内关穴对AMI引起的交感神经放电有兴奋效应。造模前,D、E组与A组放电频率相比,组间无差异;造模后0～20min,D、E组放电频率降低,与A组比较显示出组间差异性(P<0.05)。D、E组各时刻组间无明显差异,E与C组在造模后10、20min组间比较有差异性(P<0.05),提示NK1受体阻滞剂影响了电针内关对交感神经兴奋未产生明显增强效应。4.3sp阳性表达从表3可以看出,B组各部位SP灰度值小于A组,组间比较有差异性(P<0.05);C组各部位SP灰度值均高于A、B组,组间比较有差异性(P<0.05),提示AMI造模后,PVN、延髓迷走神经复合区、脊髓外侧区由于SP释放而降低,经电针内关穴处理上述三部位的SP表达增高;D、E组各部位SP灰度值低于A组,组间有差异性(P<0.05),与NK1受体阻滞剂干预后三部位SP阳性表达降低有关;与C组比较,E组三部位SP灰度值低,组间有差异性(P<0.05),提示E组电针内关处理未提高三部位SP阳性表达。4.4造模前后nos含量的变化从表4可以看出,B组各部位NOS灰度值最大,与A、C组间均显示出差异性(P<0.05),由于NOS光密度与其含量呈反比,提示造模后NOS在三部位含量减少,电针内关治疗能上调三部位的NOS的含量;D组与A组比较,三部位NOS灰度值较高,组间有差异性(P<0.05);E组与C组各部位比较,组间均显示出差异性(P<0.05),提示NK1受体阻滞剂对电针内关上调NOS表达起到了阻断作用。5sp、nos变化情况一般认为,延髓迷走神经复合区(包括迷走神经背核、孤束核)是支配心自主神经的中枢部位。下丘脑室旁核(PVN)通过下丘脑下行通路使PVN、延髓迷走神经复合区、脊髓外侧角等部位联系起来,在心血管功能活动中起到整合作用。近年来研究表明,神经肽类物质如P物质(SP)和神经递质一氧化氮(NO)均参与心血管功能活动的重要调节。NOS是NO生成过程中的最重要的限速因子,是NO合成的关键酶,因此检测组织中的NOS可反映NO生成的情况。SP、NO作为调节心血管活动的重要物质,伴随自主神经抗AMI损伤作用过程,研究中枢SP、NO如何发挥作用效应及二者之间关系对于探讨内关-心脏相关有重要意义。通过实验发现,心肌缺血时,迷走神经放电频率增加、抑制交感神经放电,致使心率减慢,此时自主神经中枢PVN、延髓迷走神经复合区、脊髓外侧角各部位SP、NOS含量减少,电针内关穴处理后迷走神经放电频率降低,交感神经放电频率增高,自主神经中枢PVN、延髓迷走神经复合区、脊髓外侧角各部位SP、NOS含量增加,提示电针内关穴抗AMI保护效应与心自主神经调