大剂量糖皮质激素对下丘脑室旁核神经元crh蛋白表达及crhmrna转录的影响

大剂量糖皮质激素对下丘脑室旁核神经元crh蛋白表达及crhmrna转录的影响

促进肾上腺皮质激素释放激素（crh）是缓解过程中最重要的初始因素之一。传统理论认为,糖皮质激素(glucocorticoid,GC)对CRH的合成分泌具有非常强烈的抑制作用。然而,Deuster等证实,大剂量GC似乎并未完全抑制CRH的增加,但尚无相关文献明确提示大剂量GC对CRH表达的影响。笔者拟通过免疫组织化学方法,首先探讨大剂量GC对下丘脑室旁核(hypothalamusparaventricularnuleus,PVN)神经元CRH蛋白表达的影响,而后采用原位杂交技术观察大剂量GC对CRHmRNA转录的作用,并以此分析大剂量GC的作用与GC受体(glucocorticoidreceptor,GR)之间的关系。1材料和方法1.1实验动物和试剂水溶性地塞米松、CRH兔抗大鼠单克隆抗体、RU486均购自美国Sigma公司,FITC羊抗兔IgG购自北京中杉公司,大鼠CRHmRNA原位杂交试剂盒购自武汉博士德公司,速眠新购自长春实验动物研究所。1.2大鼠养殖pvn神经元crh蛋白表达水平健康雄性Wistar大白鼠,60只,体重(230±10)g,由第三军医大学附属大坪医院实验动物中心提供。随机分为5组:空白对照组,等渗盐水阴性对照组、10-9mol/L地塞米松(dexamethasone,DEX)组,10-6mol/LDEX组,预先予以10-4mol/LRU486,再予以10-6mol/LDEX组。大鼠用1.0ml/kg速眠新肌肉注射麻醉后,暴露股静脉,给予相应处理(表1),15,30,60和90min后处死;正常空白对照组在相应时相点活杀观察PVN神经元CRH蛋白的表达情况。检测CRHmRNA的时相点取决于CRH蛋白表达结果,选择相应时相点的前后作为观察点。1.3crh单克隆抗体t常规冰冻切片,于视交叉后收取切片,厚10～20μm。HE染色判断所选切片是否包含PVN。免疫组织化学方法检测PVN神经元CRH表达情况,主要步骤如下:体积分数为0.1%Triton-100,30min;抗原修复液,30min;正常山羊血清封闭液,30min,不洗;1∶100兔抗大鼠CRH单克隆抗体,阴性对照用0.01mol/LPBS,4℃过夜;37℃复温1h;1∶100滴加FITC羊抗兔IgG/0.01mol/L磷酸盐缓冲剂(PBS),37℃孵育至显色。其间以0.01mol/LPBS洗3次×5min。将切片置于荧光显微镜(德国Leica公司)下观察显色结果,再利用激光共聚焦显微镜(德国Leica公司)扫描成像(包括激光扫描,透射光扫描)。阳性判断标准为绿色荧光颗粒的出现。1.4小鼠血清pvn1、ws1的检测所有相关玻璃器皿200℃烘烤8h,所有试剂均用体积分数为0.1%DEPC水配制。冰冻切片同1.3。模版序列:726TTATCGGGAAATGAAATGTTGCGCTTGGC,合成探针序列:5’GCCAAGCGCAACATTTCATTTCCCGATAA。主要步骤如下:将染色确定具有PVN核团的切片各取2张,1张用于阴性对照;1∶100甲醇过氧化氢液30min;滴加30g/L柠檬酸新鲜稀释的胃蛋白酶以暴露mRNA片段;10g/L多聚甲醛/0.1mol/LPBS,10min;预杂交:按每张切片加20μl预杂交液,置于预先加入体积分数20%甘油的预杂交湿盒中,38℃3h;杂交:每张切片加20μl杂交液,38℃过夜;阴性对照加入0.01mol/LPBS;37℃2×SSC,5min×2次;37℃0.5×SSC,15min×1次;37℃0.2×SSC,15min×1次;滴加封闭液,37℃30min,甩去多余液体,不洗;滴加生物素化鼠抗地高辛,37℃60min;滴加SABC,37℃20min;滴加生物素过氧化物酶,37℃20min;DAB显色;中性树脂封片、观察、图像采集;阳性判断标准:细胞胞浆内出现棕黄色颗粒物质。2结果2.1pvn核团的评估HE染色后,可见第三脑室顶端侧壁旁分布楔形神经元核团,为PVN所在。见图1。2.2crh阳性绿色荧光颗粒10-6mol/LDEX(血浓度)作用后30min,第三脑室顶端两侧三角形PVN出现CRH阳性绿色荧光颗粒;进一步放大后可见细胞为圆形或椭圆形(图2);其余时相点均无阳性结果。10-9mol/LDEX与等渗盐水作用15,30,60和90min后未见PVN神经元出现CRH阳性荧光颗粒,空白对照组各时相点未见阳性结果。2.3pvn细胞群根据结果2.2,选择15,20,30和40min为观察点,10-6mol/LDEX作用约20min,PVN神经元胞浆内出现CRHmRNA阳性棕黄色颗粒,但未存在于视野下所有细胞胞浆内;复染后可见第三脑室壁旁的PVN细胞群(图3);其余时相点内未见阳性结果。10-9mol/LDEX、9g/L等渗盐水以及空白对照组在各时相点均未出现阳性结果。预先从股静脉予以10-4mol/L(终浓度)的RU486约60min后,再给予10-6mol/LDEX,20min后,PVN未出现CRHmRNA阳性结果;30min后,PVN未出现CRH蛋白阳性绿色荧光颗粒。3gc对pvn神经元crh表达的影响CRH是含有41个氨基酸的无半胱氨酸的小分子肽类激素,相对分子质量为4871。CRH的合成部位主要位于PVN部位的小细胞群中,两侧仅共有约2000个CRH神经元。虽然外周某些组织器官(胃肠、胰腺、肾上腺、胎盘、皮肤等部位)也可表达CRH,但其浓度大大低于PVN水平。因此,本实验中采用免疫组织化学技术和原位杂交方法检测CRH的表达情况。CRH作为下丘脑-垂体-肾上腺(HPA)轴系统中最上级的激素,启动了HPA轴对应激原的应答;此外,CRH还参与了交感-肾上腺髓质系统的活化。此两系统为应激状态下机体产生的重要病理生理过程。因此,一般认为CRH是应激过程中重要的始动因子之一,CRH分泌增加可作为反映机体应激状态的客观指标。GC通常被认为是CRH基因转录最重要的负调控因素,因为CRH启动子区域-278～-249bp为GC负反应元件(negativeglucocorticoidresponsiveelement,nGRE),GC与经典的细胞内受体(intracellularglucocorticoidreceptor,iGR)结合后对其具有较高的结合能力,起到抑制CRH基因表达的作用。此外,GC·iGR复合物还能干扰CRE与其结合蛋白(cAMPrespondingelementbindingprotein,CREB)的结合,能通过GRDNA结合域中的锌指状结构与Fos形成蛋白-蛋白(protein-to-protein)结合,降低活化蛋白(AP)-1与DNA的结合总量,从而间接使得CRH基因表达下降。但文献资料与临床病例均提示,在大剂量GC存在的条件下,CRH仍可维持较高水平。目前,但国内外尚无具体调节方式的相关报道。本实验结果表明,大剂量GC具有上调PVN神经元CRH表达的作用,该作用明显不同于经典的GC作用。同时,实验结果也提示,大剂量GC对CRH的上调作用可能与新近认识到的GC膜受体(membraneglucocorticoidreceptor,mGR)密切相关,因为:(1)越来越多的证据显示,神经元细胞膜上存有mGR。(2)RU486为GR特异性拮抗剂,能结合iGR和mGR,且亲和力分别高于所有GC,笔者利用10-4mol/LRU486拮抗GR后,大剂量GC的作用被逆转,提示大剂量GC的作用是由GR介导的。(3)根据受体-配体结合特性,饱和iGR需10-9mol/LGC,饱和mGR却需10-6mol/LGC。因此大剂量的GC与饱和mGR所需的量具有很好的一致性,但大于饱和iGR所需的量近1000倍。由于10-9mol/LDEX并不能导致PVN神经元表达CRHmRNA及其蛋白,而大剂量GC却具有非常明显的上调作用,表明大剂量GC的作用可能与传统的iGR无关。(4)大剂量GC起效时间仅为几十分钟,与GC非基因组机制所需时间相吻合,但低于传统的GC基因组机制发挥效应所需的几小时,甚至几十小时。目前普遍认为,GC非基因组机制主要依赖于mGR,而后者主要与iGR相关。