小分子活性肽在药物研究中的应用

小分子活性肽在药物研究中的应用

作为药物、疫苗、诊断试剂和药物筛选剂的新趋势，已成为药物研究的趋势。1.噬菌体克氏原螯虾生物活性噬菌体展示肽库是将编码短肽的外源基因插入到丝状噬菌体基因Ⅲ(gⅢ)或Ⅷ(gⅧ),使得多肽以融合蛋白形式连接在PⅢ或PⅧ的N端,表达在噬菌体颗粒表面,而多肽的表达不影响和干扰噬菌体生活周期,然后利用生物素或酶标记的抗体或受体,细胞因子为钓饵分子筛选出特异的噬菌体,并进行扩增、再筛选,得到目的短肽克隆,然后对所选出的噬菌体克隆进行DNA测序,并从DNA序列推导氨基酸序列,进而进行短肽的化学合成,验证生物活性。典型的例子是利用噬菌体展示方法,分离得到一20个残基的肽,它能模拟红细胞生成素的活性,促进红细胞生成素的二聚化和激活。噬菌体展示肽库技术具有高库容、高效方便及灵活等特点。其缺点是库容多样性易受到多种因素的影响,且获得的是小分子肽亲和力较低。表1列举一些筛选肽类的例子。2.-ngf肽链此法为经典方法,结合目前先进的分离和检测技术,尤其是亲和色谱为基础的各种方法和仪器的使用,使从降解的肽混合物中快速有效的分离活性肽成为可能。化学法用CNBr作用于Met-X,NTCB作用于Lys-X,IBA作用于Trp-X,甲醇作用于Asp-Pro;酶法用胰蛋白酶、胃蛋白酶等。例如:神经生长因子(NGF)能够促进交感神经原的成熟,并维持其正常功能,在中枢神经中有重要的生理意义,在治疗和预防神经系统退化性疾病,早老性痴呆症、帕金森综合征、脑血栓后遗症等方面有良好的应用前景。由于血脑屏障,NGF大分子肽链难以发挥作用。李贤慧等根据NGF的氨基酸序列及其晶体构象资料对β-NGF进行化学和酶解,选择溴化氰在9位Met处,胰蛋白酶在Arg或Lys处裂解β-NGF,用SephadexG50色谱,DE52离子交换色谱和反相高效液相色谱进行分离纯化,获得片段用pc12细胞测活,获得一可诱导pc12细胞分化的活性片段。此片段有16肽(GEFSVCDSVSVWVGDK)与14肽(HWNSYCTTTHTFVK)通过一对二硫键连接而成,二片段与β-NGF肽链的10～25和77～88位氨基酸残基序列相对应,最佳活性作用浓度为1～100mg/L。应用降解法已成功从多种蛋白质,如α酪蛋白、β酪蛋白、谷蛋白、细胞色素b、珠蛋白、血清白蛋白和肌醇激酶、肌细胞增强蛋白、乙酰胆碱脂酶等中分离得到吗啡样小肽和多种蛋白质抗原表位多肽。3.mhc-多肽结合模体的构建主要组织相容性复合体(majorhistocompatibilitycomplex,MHC)在抗原的递呈和T细胞的激活中起重要作用。T细胞的激活及发挥免疫作用的先决条件是MHC和抗原之间紧密结合,形成一个复合体。在这个复合体中,与MHC结合的不是完整的抗原分子,而是短肽。研究表明在MHC-1类和MHC-2类的分子顶部都存在一个狭长裂缝,MHC-1正好与8～10氨基酸多肽结合,MHC-2与大约10～15个氨基酸多肽结合,尤其是MHC-1结合肽含有保守性氨基酸,同一MHC等位型具有一致的MHC特异的多肽结合模体(MHCbindingmotif)。因此根据MHC-多肽复合体三维构象,结合多肽的氨基酸序列信息以及MHC类分子多态性可以指导抗原性多肽的设计,目前已有多种MHC结合肽预测软件。表2是一些等位型MHC-多肽序列。4.cd4抑制剂的设计近年来由于结构生物学的发展,运用X射线晶体技术,核磁共振(NMR)技术,相当数量的蛋白质以及一些核酸、糖类的三维结构已被人们精确测定,到2003年9月2日在PDB(proteindatabank)库中收集的生物大分子空间结构数据已达到22333套,其中蛋白质,肽和病毒20152套,蛋白质和核酸复合物934套,核酸1229套,糖18套。这使基于蛋白质和核酸结构上的药物分子设计成为可能,任何药物都是通过受体发挥作用,而受体往往是蛋白质或核酸。知道大分子结构,就容易发现哪些成分与受体发生特异结合,以及相互结合的位点,使得药物的筛选与设计有科学依据,避免盲目性。如Takasaki等根据TNFα和TNFβ/TNF-1受体复合物的晶体结构,设计了与TNF-1受体三个关键结合点相对应的小分子外环模拟肽,用可溶性TNF-1受体和完整的TNF-1受体评价模拟肽的拮抗活性,其中,WP9QY序列为YCWSQYLCY,拮抗性最好,IC50为5μmol/L。此肽模拟TNF-1受体3功能区1环即最关键的相互作用点,有效地抑制TNF-α介导的细胞凋亡。CD4和主要组织相容性复合体结合,使CD4+T细胞活化,而活化CD4+T细胞参与许多自身免疫疾病和移植物排斥反应。Satoh等依据CD4CC′环区设计一系列线性肽。其中NSNQI位于CD4D1CC环活性区,与CD4D1和CD4D2晶体结构观察到的相同。为增加结构稳定性将其设计成环七肽Ⅳ(CNSNQIC),高分辨率核磁共振分析表明此肽密切模拟CD4区1CC′表面环。七肽Ⅳ有效的阻断CD4与MHC-Ⅱ复合体的形成,在体内和体外具有重要的免疫活性,并能抵抗蛋白酶的水解作用,有望成为免疫抑制药物。本方法也有局限性,如X射线晶体技术需要适当的蛋白质晶体,NMR现在还不能测定分子量大于30kD的样品。5.体外膜信号转染虽然X射线晶体技术,核磁共振(NMR)技术等为蛋白质空间结构测定提供有效手段,并以每天得到几个生物大分子空间结构的速度前进,但是这些方法提供蛋白质三维结构的速度还远小于蛋白质序列信息的增长速度,加上这些方法本身的局限性,使得理论模拟与结构预测就越显重要。蛋白质空间结构预测大致分为同源预测,从头预测,折叠识别(foldrecognition)。同源预测是把待测的未知结构的蛋白质分子的序列与已知结构的蛋白质分子序列进行比较,根据序列的相似性找出同源蛋白作为模板构建待测蛋白质分子结构。如很多肿瘤细胞过表达酪氨酸蛋白激酶erbB家族受体,这些受体是基于结构设计的重要靶标,已知erbB受体同源或异源聚合对受体信号转导至关重要。为阻止受体聚合,Berezov等利用同源模建方法,以层粘蛋白g1Ⅲ3～5(1KLO)的晶体结构和胰岛素样生长因子-1受体(1IGR)的晶体结构为参照模板,分别预测了erbB2-sbdⅣ和erbB1胞外功能区的三维结构。根据已有的实验结果,建立erbB1-EGF复合体三维结构模型;利用计算机模拟分析手段设计来源于erbBⅣ亚区C端限制性环肽:YCPIWKFPDEECY、YCPIYKYPDVQCY、YCLVWKYADAGCY、YCPIFKYADPPDCY、YCFPDEEGACY。这些肽选择性的结合erbB受体胞外功能区和erbB2Ⅳ亚区(亲和力达μm)并抑制heregul诱导的erbB3与不同erbB受体作用,对转染不同组合erbB受体细胞系32D呈剂量依赖性抑制作用。这些肽还有效地抑制了两种转染不同erbB受体细胞T6～17和32D的生长。这种方法的优点是预测准确,精度高,但仅适用于有已知结构的同源蛋白质。6.反义同源盒原理1995年Baranyi等提出了反义同源盒原理,该理论基础是:蛋白质分子相互识别的信息储存于它们的编码序列中,编码受体基因的反义核酸序列中的特定片段,是编码配体中识别受体位点的有义序列。反义同源盒是两种蛋白质间或一种蛋白质内高密度正义-反义氨基酸的配对区。双螺旋结构的DNA由互补的正义链(sensestrand)和反义链(antisensestrand)两条链组成,正义链可以转录成mRNA,进而翻译成多肽和蛋白质,也称正义肽或蛋白质;反义DNA链可转录成反义mRNA,它所编码和翻译的肽和蛋白质为反义肽(antisensepeptide)。一般情况下,DNA反义链不能转录成mRNA,也不能翻译成蛋白质。在正义DNA链上编码亲水性氨基酸残基的密码子,其同一阅读框内所对应的反义DNA链上大多会编码疏水性氨基酸,反之亦然。目前研究资料表明正义—反义多肽相互作用可能广泛存在于多肽-多肽,多肽-蛋白质,蛋白质-蛋白质之间,因此根据其作用原理可指导识别天然小分子活性肽的分子设计。反义同源盒原理虽然未被广泛接受,但根据此原理设计的