ghrelin对大鼠下丘脑和垂体的调控

ghrelin对大鼠下丘脑和垂体的调控

ghrelin是1999年日本科学家cotomima等从大鼠胃中提取并确定的特定内源性配体（ghsr）。28个氨基酸残基由这些氨基酸残基组成，第三组丝氨酸残基中有n-serge，n端第三部分氨基酸含量为n-i。该基团对维持自身的生物活性是必须的,去N-端辛酰基化后,则其失去生物活性。Ghrelin在大鼠等多种动物的中枢神经系统和外周组织器官中均有分布。Ghrelin作为内分泌系统新发现的成员之一,其在生长素分泌和能量平衡调节中的地位已被肯定,而生殖活动作为动物机体代谢的特殊活动形式,与体内的能量代谢密不可分。近年来,越来越多的研究表明,Ghrelin与动物生殖息息相关。Fernandez-Fernandez等报道,在成年雌性大鼠发情周期的任何阶段,进行脑室内注射Ghrelin均能抑制促黄体素(Luteinizinghormone,LH)的分泌,而仅在发情后期减少促卵泡素(Follicle-stimulatinghormone,FSH)的分泌。除此以外,在卵巢切除的大鼠中,Ghrelin还可减少促性腺激素释放激素(Gonadotrophin-releasinghormone,GnRH)的分泌。Torsello等通过RT-PCR方法发现在大鼠的腺垂体中,GhrelinmRNA在出生后维持很高的水平,在初情期时显著下降,但在下丘脑中,出生时几乎检测不到GhrelinmRNA,随后一直保持较低的水平。现有的研究均表明,Ghrelin在动物下丘脑—垂体水平上对动物生殖内分泌功能的调控发挥着重要作用。目前,关于Ghrelin在下丘脑、垂体中的定位虽有报道,但仍不完整,有些分布与表达仍存在争议,且多集中在Ghrelin参与摄食和能量代谢调控核团的研究。国内外关于GhrelinmRNA的研究多在定量方面,如Hou等采用RT-PCR方法研究了GhrelinmRNA在大脑皮层中的表达,缺少从分子水平上对GhrelinmRNA在细胞学的定位研究。本试验以性成熟的大鼠为试验动物,采用免疫组化和原位杂交相结合的方法探讨Ghrelin及其mRNA在大鼠下丘脑、垂体内的分布,为进一步阐明Ghrelin参与动物生殖调控提供科学的理论依据。1材料和方法1.1试验动物成年SD大鼠(180~240g)8只,雌雄各半,购自安徽医科大学实验动物中心,室温(22~25℃)饲养,自由摄食与饮水。1.2免疫组化检测试剂Ghrelin一抗为兔抗鼠Ghrelin多克隆抗体,购自美国Sigma公司。PV-9000两步法免疫组化检测试剂盒,DAB显色试剂盒均购自北京中衫金桥生物技术有限公司。地高辛标记的Ghrelin寡核苷酸探针,原位杂交检测试剂盒均购自武汉博士德。组织切片机(YD-158R轮转式切片机),Nikon显微镜照相系统。1.3组织病理学(1)处死大鼠,取下丘脑、垂体组织。(2)组织经4%多聚甲醛固定24h。(3)弃去固定液,流水冲洗固定组织12h,梯度酒精脱水。(4)二甲苯透明、浸蜡、包埋。(5)切片:免疫组化、原位杂交分别采用5、7μm连续切片,切片粘贴在多聚赖氨酸处理载玻片上。1.4免疫组化检测(1)在40℃恒温箱内过夜干燥切片,二甲苯脱蜡,梯度酒精处理,水化。(2)热修复抗原:将切片浸入0.01mol·L-1枸橼酸盐缓冲液(pH6.0),微波炉加热至沸腾后断电,间隔5~10min后,反复1~2次。冷却后PBS(pH7.2~7.6)洗涤1~2次。(3)用3%(V/V)H2O2室温孵育10min以灭活内源性过氧化物酶,PBS洗3次。(4)滴加Ghrelin一抗(1∶200),4℃过夜。(5)按照PV-9000两步法免疫组化检测试剂盒说明,滴加polymerhelper(GBI,USA),37℃孵育20min,PBS洗3次,每次2min。(6)滴加Polyperoxidase-anti-mouse/rabbitIgG(GBI,USA),37℃孵育30min,PBS洗4次,每次5min。(7)DAB显色20s,蒸馏水洗涤。(8)苏木素轻度复染,脱水,透明,封片。对照组用PBS代替一抗,其余步骤同上。1.5rtcaaagaggg-3使用地高辛标记的Ghrelin寡核苷酸探针,其序列如下:(1)5′-CACCAGAAAGCCCAGCAGAGAAAGGAATCCAAGAA-3′;(2)5′-TGGCTCCACCCAGAGGACAGAGGACAAGCAGAAGA-3′;(3)5′-CAGGATATCCTCTGGGAAGAGGTCAAAGAGGCGCC-3′。所有溶液用DEPC水配制。原位杂交程序均按试剂盒(武汉,博士德)说明进行。(1)杂交前处理。切片,常规脱蜡水化。3%(V/V)H2O2去离子水孵育10min,蒸馏水洗3次。胃蛋白酶37℃或室温消化3~30min,暴露mRNA核酸片段。用1%(M/V)多聚甲醛室温固定10min,蒸馏水洗涤3次;(2)预杂交。杂交盒底部加20%(V/V)甘油20mL以保持湿度。每张切片加20μL预杂交液,40℃恒温箱中作用3h,吸取多余液体,不洗;(3)杂交。每张切片加20μL杂交液,恒温箱中40℃杂交过夜(时间可根据杂交情况调节);(4)杂交后处理。揭掉盖玻片,37℃2×SSC、0.5×SSC、0.2×SSC各洗涤15min,加封闭液37℃作用30min,甩去多余液体,不洗,滴加SABC、37℃、20min或室温30min,原位杂交专用PBS洗3次,每次5min,滴加生物素化过氧化物酶,37℃、20min或室温30min,PBS洗4次,每次5min。DAB显色,苏木素复染,充分水洗,酒精脱水,二甲苯透明,显微镜观察。1.6形态分析及浓度测定Ghrelin及其基因染色以细胞核或细胞浆呈棕黄色为阳性,每组切片中随机选取5张,对阳性区域进行拍照,用MoticImagesplus2.0形态分析软件对阳性细胞进行分析,测量阳性细胞的灰度值和数目。灰度值用平均数±标准差表示,其余的用平均数表示。2结果2.1治疗涤纶阳性神经元的细胞在正中隆起(图1A)、弓状核、腹内侧核、室旁核等部位存在大量Ghrelin阳性神经细胞(图1B),各部分核团细胞着色深浅不一,如表一。胞体呈不规则的圆形、卵圆形、梭形、三角形等,神经元胞质内充满棕色的反应颗粒,核位于中央或偏向一侧(图1A、B);对照组无阳性细胞(图1C)。2.2少数腺细胞测定神经垂体无阳性细胞分布(图2A),腺垂体中少数腺细胞呈阳性,如表1。胞质着色较深,胞核为阴性,且染色不一致。胞体呈圆形、卵圆形等(图2B)。对照组无阳性细胞(图2C)。2.3细胞内表达系统GhrelinmRNA主要在下丘脑弓状核、腹内侧核(图1~3A)、正中隆起、室旁核等(图1~3B)的细胞内表达。阴性对照组则没有表达(图1~3C)。2.4色的阳性反应颗粒,神经部分在大鼠腺垂体的大部分腺细胞胞质内充满棕色的阳性反应颗粒,核周也有少量着色(图4A、B),而神经垂体则无(图4A)。阴性对照组未见阳性反应产物(图4C)。3grtelinmrna在腺垂体细胞中的表达本试验结果表明,Ghrelin主要分布在大鼠下丘脑的弓状核、腹内侧核、正中隆起、室旁核等区域,这与Miller等在绵羊和Judit等在人类下丘脑中的Ghrelin研究结果一致,这意味这Ghrelin在哺乳动物下丘脑中的分布可能没有物种差异性。下丘脑的弓状核、腹内侧核、正中隆起等区域有神经末梢和神经肽Y、刺鼠相关蛋白、阿片促黑素细胞皮质素原等神经元相连,且此区域内神经元多与动物的采食、体质量、能量平衡以及生殖激素的调节有关。因此,Ghrelin可能在动物的摄食、能量代谢与生殖调控之间发挥着桥梁与纽带作用。另外,形态学研究已证实在下丘脑弓状核、腹内侧核和正中隆起等区域分布GnRH神经元胞体及纤维,是参与调节生殖内分泌功能的重要区域,尤其是正中隆起处,大约有50%~70%的GnRH神经元投射到正中隆起,支配腺垂体LH的分泌。由此可见,Ghrelin在下丘脑这些核团中的分布,为Ghrelin参与调节GnRH神经元的活动奠定了组织学基础。目前,对GhrelinmRNA在动物下丘脑中表达的研究资料大多是关于定量方面的,如张文龙等用实时荧光RT-PCR方法检测了发情期和间情期大鼠的下丘脑中GhrelinmRNA的表达丰度。而对于GhrelinmRNA在下丘脑的细胞学定位研究较少,特别是具体的分布规律仍不清楚。我们通过原位杂交试验对GhrelinmRNA在大鼠下丘脑中的表达进行了研究,发现在大鼠的整个下丘脑中均有GhrelinmRNA表达,其中在下丘脑弓状核、腹内侧核和正中隆起、室旁核等处的核团中有大量表达。这与GhrelinmRNA在人下丘脑中的分布类似,也与Ghrelin在下丘脑中的分布一致。我们通过用图像分析系统对两组试验内阳性细胞进行计数,并进行灰度值分析,也显示了Ghrelin与GhrelinmRNA分布的一致性。同时,我们的研究结果进一步从分子水平上阐明了Ghrelin和GnRH之间的内在联系。Ghrelin可能是GnRH分泌的一个新的调控因子,但对于Ghrelin是直接作用于GnRH神经元还是通过其他介质介导还有待于进一步研究。在大鼠脑垂体中,我们发现Ghrelin主要分布在腺垂体的少数腺泡细胞内,而神经垂体未见其表达。Miller等发现Ghrelin主要分布在绵羊腺垂体中。腺垂体是促性腺激素分泌中心,是LH、FSH、LH-FSH3种促性腺激素细胞在脑垂体中密集分布区域。Ghrelin免疫阳性细胞在腺垂体中的大量分布说明了Ghrelin可能参与促性腺激素的分泌。通过原位杂交试验发现,GhrelinmRNA在腺垂体的大部分腺细胞中表达,神经垂体中无GhrelinmRNA表达,这同Ghrelin在垂体上的分布并不完全一致。阳性细胞计数,灰度值分析结果也显示Ghrelin与GhrelinmRNA之间的差异性。这意味着Ghrelin在腺垂体细胞中差异性表达。李连香等报道GnRH的受体主要分布在腺垂体,而GhrelinmRNA也分布在类似区域,它们之间可能有