侧脑室内注射吗啡预处理对大鼠心肌缺血再灌注损伤的影响及机制

侧脑室内注射吗啡预处理对大鼠心肌缺血再灌注损伤的影响及机制

根据最近的研究，通过预处理来预防和治疗吗啡，骨髓机制中的三种阿片受体、和参与了干预。另外在有关预处理早期和延期心肌保护研究发现,缺血或单磷酸类脂A预处理均可以使得内源性的降钙素基因相关肽(calcitoningenerelatedpeptide,CGRP)释放增加,从而认为其可能在这种保护作用中起着关键的角色。吗啡是临床上常用的镇痛药物,P物质(substanceP,SP)在痛觉的传递中起着关键的角色。下丘脑室旁核(hypothalamicparaventricularnucleus,PVN)对心血管功能具有调节作用。有研究表明吗啡静脉预先给药可以降低急性心肌缺血大鼠心肌组织SP的表达。本研究主要观察侧脑室注射吗啡预处理对在体大鼠缺血后心脏的影响及其可能的机制。1材料和方法1.1动物模型1.1.1动物侧脑室固定SD大鼠(300±25)g,♂。5%戊巴比妥钠40mg·kg-1,ip。麻醉后的大鼠固定在脑立体定位仪(蓝星B型,淮北振华生物科技有限公司)上,裸露颅骨,根据Paxinos-Watson图谱定位侧脑室置管位置(坐标:P1.5mm,R1.5mm,H3.0mm),用大鼠颅骨钻钻孔,将内径0.36mm、外径0.71mm导管插入侧脑室,脑脊液流出后,插入内芯,用502胶混合牙托粉固定在颅骨上,以备侧脑室给药用,术后肌注青霉素10万U,动物均予以分笼单独饲养3d,以备实验。有感觉或运动障碍大鼠弃去。1.1.2右股动脉开口置管所有成功侧脑室内置管的大鼠,5%戊巴比妥钠40mg·kg-1,ip。麻醉后气管切开、插管后连接动物呼吸机(HX-300型,成都泰盟生物科技有限公司)行机械通气,潮气量2～4ml·kg-1,频率70～80次。右股动脉切开置管,接压力换能器,连接PowerLabSystems(AD公司,澳大利亚),记录心电图(ECG)、血压(BP)和心率(HR);右股静脉切开置管用于输液。沿左锁骨中线切开皮肤2cm,在左4～5肋间打开胸腔,剪开心包,轻压右侧胸廓,挤出心脏。在动脉圆锥与左心耳之间结扎左冠状动脉,方法是用6-0Prolene线(强生公司,美国)作一线结,把心脏放回胸腔。稳定15min后,收紧线结即形成左冠状动脉闭塞致心肌缺血,表现其支配的局部心肌发绀、血压下降,ECG呈心肌梗死改变(ST段抬高或降低等);松开线结即可实现再灌注。实验结束侧脑室内注射亚甲蓝,确定侧脑室置管的位置准确性和有无损伤脑组织。1.2试剂与试剂盒吗啡(批号070808,沈阳第一制药厂),三氟拉嗪(trifluoperazine,TFP,Sigma公司),氯化三苯基四氮唑(TTC,Sigma公司,使用浓度为100mmol·L-1,磷酸盐缓冲液pH7.4,溶解),兔抗大鼠SP多克隆抗体(Chemicon公司),兔抗大鼠钙调蛋白多克隆抗体(CellSignalling公司),ECL发光试剂盒(Pierce公司),兔抗大鼠β-actin抗体、辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG、S-P通用型免疫组化试剂盒及DAB显色试剂盒均购自北京中杉金桥公司,CGRP试剂盒(解放军总医院东亚免疫技术研究所)。1.3tfp的制备成功建立动物模型的48只大鼠,随机分为两部分实验。第一部分观察侧脑室内注射吗啡预处理对在体大鼠心肌缺血/再灌注损伤的影响,探讨钙调蛋白介导释放CGRP在其中的作用。随机分为4组,每组6只:①对照组(CON组),在缺血/再灌注前30min内,侧脑室内微量泵注射0.9%生理盐水5μl5min,停止注射5min,重复3次,共计15μl;②预处理组(MPC组),在缺血/再灌注前30min内,侧脑室内用微量泵恒速注射吗啡(1μg·kg-1,用生理盐水稀释到5μl)5min,停止5min,重复3次;③TFP+MPC组:在侧脑室内注射吗啡预处理前10min一次侧脑室内给予TFP(浓度为20g·L-1)5μl;④TFP自身对照组(TFP组),TFP组剂量与方法同TFP+MPC组。第二部分观察侧脑室内注射吗啡预处理对在体大鼠下丘脑室旁核、心肌缺血区和非缺血区SP的影响,以探讨痛觉的干预在这种保护效应中的作用。随机分为3组,每组6只:①假手术组(Sham组),大鼠开胸后在冠状动脉左前降支下穿线不结扎,也不给予任何处理;②对照组(CON组)和③预处理组(MPC组)处理的方法均同第一部分。1.4观察指标1.4.1动脉压和心率计算比较各组手术稳定后15min(基础值)、处理后、缺血30min后和再灌注120min后平均动脉压(MBP)和心率(HR),计算平均动脉压和心率乘积(RPP)。1.4.2速冻心脏检查在再灌注120min时,取出心脏,去除非心脏组织,生理盐水灌注,冲洗出血液,结扎左冠状动脉,从主动脉用注入0.25%Evan氏蓝溶液。置-80℃冰箱备用。将速冻心脏从心尖到心基平切5～6片2mm厚的心肌片。置1%氯化三苯基四氮唑溶液中,37℃(pH7.4)温孵15min,染色,然后用10%福尔马林固定,缺血危险区为红色,梗死区为白色,用SigmaScanprogram4图像分析软件计算左心室(LV)、右心室(RV)、缺血危险区(AAR)和梗死区(IS)体积,然后计算左心室(LV)与右心室(RV)体积之和,心肌梗死面积用梗死区与缺血危险区面积之比(IS/ARR)表示。1.4.3抑肽酶活性测定在再灌注120min时,从股动脉取2～3ml血,加入含有100g·L-1乙二胺四乙酸钠30μl和抑肽酶40μl的试管中,混匀,3000r·min-1离心10min,分离血浆,-20℃下保存待测定。采用放射免疫法测定血浆中CGRP含量。1.4.4sp法检测mr垂直冠状面切下pvn的表达在再灌注120min时,快速取出心脏,并从颈动脉向脑组织灌注4%多聚甲醛100ml,根据Paxinos-Watson图谱在前囟后1.8mm垂直冠状面切下含有PVN的脑组织。常规固定和包埋脑和心脏标本,用切片机连续5μm厚的冠状切片、脱蜡,SP一抗按1∶7500稀释,并按S-P法进行免疫组化染色,同时设阴性对照(用PBS替代第一抗体),在倒置相显微镜(Olympus,Japan,×400)下拍取图像。用Image-proplus6.0版图像分析软件进行图像分析测定累积光密度(integratedopticaldensity,IOD)。1.4.5辣根过氧化物酶检测在再灌注120min时,分离双侧海马,常规提取蛋白,蛋白定量后SDS电泳、PVDF膜转印,5%脱脂奶粉封闭2h,加兔抗大鼠CaM一抗(1∶1000)孵育过夜,辣根过氧化物酶标记山羊抗兔(1∶5000)37℃2h,ECL化学发光显色,曝光、显影、定影。利用Image-proplus6.0版图像分析软件进行图像分析测定X线片上条带的平均光密度值,以目的蛋白条带与β-actin蛋白条带平均光密度值的百分比值表示相对含量。1.5统计学处理方法采用Prism4.0统计学软件进行分析。计量资料以x¯±s表示,组间比较采用单因素方差分析,两两比较采用Newman-Keuls分析。2结果2.1第一部分实验的结果2.1.1活检时间和再灌注时点与基础值相比,各组HR、MAP和RPP在缺血30min和再灌注120min都有降低,但各时点比较差异均无统计学意义(P>0.05),Tab1。2.1.2侧脑室内注射对心肌缺血/再灌注损伤的影响各组左心室(LV)与右心室(RV)体积之和、AAR体积差异无显著性(P>0.05)。与CON组相比,MPC组IS体积和IS/ARR均明显降低(P<0.01),表明侧脑室内注射吗啡预处理对心肌缺血/再灌注损伤具有保护作用。TFP组和TFP+MPC组分别与CON组相比差异无统计学意义(P>0.05),而与MPC组相比其IS体积和IS/ARR均明显增加(P<0.01),表明三氟拉嗪(TFP)本身对IS体积和IS/ARR没有影响,但可消除侧脑室内注射吗啡预处理对心肌缺血/再灌注损伤的保护作用,Tab2。2.1.3tfp+mpc的研究与CON组相比,MPC组血浆中CGRP水平明显升高(P<0.01);而TFP+MPC组与MPC组相比其水平又明显降低(P<0.01),表明侧脑室内注射吗啡预处理可以使得血浆中CGRP释放增加,而应用钙调蛋白抑制剂三氟拉嗪(TFP)后又能消除血浆中CGRP释放增加这种效应,Tab2。2.1.4不同侧脑室内注射预处理对海马钙调蛋白表达的影响与CON组相比,MPC组大鼠海马中钙调蛋白的表达明显增高(P<0.01);而TFP+MPC组和TFP组分别与CON组比较差异无统计学意义(P>0.05),但均低于MPC组(P<0.01),表明侧脑室内注射吗啡预处理可以使得海马钙调蛋白的表达水平增高,而应用钙调蛋白抑制剂三氟拉嗪(TFP)后又能消除这种增加的效应。Fig1。2.2两组心肌损伤的比较下丘脑室旁核(PVN)、心肌缺血区与非缺血区SP的表达:PVN和心肌免疫组化结果显示SP阳性细胞质被染成棕黄色、胞核不着色。与Sham组相比,CON组心肌有明显的损伤,缺血区心肌纤维排列紊乱,有坏死和融合区;而MPC组可以明显降低这种损伤。与Sham组相比,CON组下丘脑室旁核、心肌缺血区和非缺血区SP的表达水平均明显增加(P<0.01);而MPC组则与CON组比较,下丘脑室旁核、心肌缺血区和非缺血区SP的表达水平明显降低(P<0.01,P<0.05)。以上表明心肌缺血/再灌注损伤可以使下丘脑室旁核和心肌P物质表达明显增加,而经过侧脑室内吗啡预处理后其表达均明显降低,Fig2、3,Tab3。3药物预处理和crp对心肌保护作用的影响本研究发现侧脑室内注射吗啡预处理对在体大鼠心肌缺血/再灌注损伤具有保护作用,其保护作用可能由海马组织中钙调蛋白调节内源性的CGRP的释放所介导;同时这种保护效应可能还与痛觉的干预有关。中枢神经系统分布有大量的阿片受体,所以对在体动物,阿片类药物的作用不仅仅作用于心脏阿片受体,同时也作用于中枢阿片受体。另外,已知中枢神经系统阿片受体的激动会对心血管产生调节作用,其机制可能通过中枢抑制交感张力和直接或间接扩张血管作用等,并且含有阿片受体的中枢核团参与了镇痛和心血管功能的调节。Groban等研究发现鞘内注射吗啡可以降低心肌缺血/再灌注损伤引起的心肌梗死面积,与静脉吗啡作用相似。我们最近的研究进一步证明鞘内注射吗啡预处理产生心肌保护效应,并且脊髓中枢上的κ、δ和μ3种阿片受体均介导这种效应。于是我们通过侧脑室内注射吗啡,其可以直接与中枢阿片受体结合,发现明显降低缺血后心肌梗死面积,对在体大鼠心肌缺血/再灌注损伤具有保护作用。LV:leftventricle;RV:rightventricle;AAR:areaatrisk;IS:infarctsize.**P<0.01vsCONgroup;##P<0.01vsMPCgroupnon-ischemiamyocardialarea:A:Shamgroup;B:CONgroup;C:MPCgroup;ischemiamyocardialarea:D:Shamgroup;E:CONgroup;F:MPCgroup下丘脑参与疼痛的调节机制,在这些部位阿片受体分布极为丰富,是阿片样物质参与调节疼痛的重要基础。另外下丘脑还是心血管功能调节的中枢。研究证明SP在心血管应激反应中起着非常重要的角色。而在心肌缺血等应激情况下,下丘脑室旁核和心肌上SP的表达增加,通过应用静脉吗啡预先给药可以降低急性心肌缺血引起的SP表达的增加。另外有研究证明鞘内注射左旋布比卡因所产生的镇痛效应与脊髓背角和远位触液神经元SP表达水平下调有关,进一步证明SP在痛觉传递的过程中起着关键的角色。本研究结果表明CON组与Sham组相比,其下丘脑室旁核、心肌缺血区和非缺血区SP表达明显增加,而MPC组与CON组相比其SP表达明显减少,说明侧脑室内注射吗啡预处理产生心肌保护的效应可能与SP有关。痛觉的干预是急性心肌梗死治疗中的一项措施,所以我们可以推测侧脑室内注射吗啡预处理产生心肌保护效应的机制可能与痛觉的干预有关。CGRP是一种神经递质,有强心、扩张血管的作用,是目前发现的最强大的内源性血管舒张物质。短