超级感受态细胞的制备方法

什么是感受态细胞野生型E.coli并不容易转化，这是由于细菌产生一种酶能迅速降解进入的外源DNA。经过多年的努力，科学家们发现了一种方法可以增加细胞吸收外源DNA的效率。那就是用化学方法处理细胞，使其改变膜对DNA的通透性。这种细胞就称为感受态细胞，即细胞处于能摄入核酸分子时的生理状态。这种方法已经成为基因工程的常规技术，它对于我们利用体外DNA重组技术来了解真核和原核生物的基因功能特别重要。细菌的转化有两种类型：一种是自然转化(naturaltransformation)，在自然转化中细菌可以自由地吸收DNA，通过它来进行遗传转化；另一种是工程转化(engineeredtransformation)，在这种转化中，细菌发生改变使得它们能摄入并转化外源DNA。枯草杆菌中的转化属于自然转化，E.coli转化就属于工程转化。DH5a是一种常用于质粒克隆的菌株。E・coliDH5a在使用pUC系列质粒载体转化时，可与载体编码的卩一半乳糖苷酶氨基端实现a—互补。可用于蓝白斑筛选鉴别重组菌株Transformation"Ultra-Competent"E.coli(InoueMethod)Inoue法制备大肠杆菌超级感受态细胞Inoue,H.,H.Nojima,andH.Okayama.1990.HighefficiencytransformationofEscherichiacoliwithplasmids.Gene96:23-28.CitationAbstractProcedure步骤InoculatefromanovernightgrowninLB.从培养过夜的LB平板上挑取单菌落Growin250ml"SOB"at18CuntilOD600=0.6. (0.3)接种于250mLSOB,18度培养至OD=0.62.Onicefor10minutes.菌液置冰上10分钟Spinat2500xg(5000rpminaSorvallGSAor3000rpminaBeckmanJ-6Bcentrifuge)for10min.at4C.4度2500g离心10兮钟Resuspendcellsgentlyin80mloficecold"TB".小心用80mL预冷TB重悬细胞Onicefor10minutes.(30min)菌液置冰上10分钟Spinat2500xg(5000rpminaSorvallGSA,5500rpminaSorvallSS-34,or3000rpminaBeckmanJ-6Bcentrifuge)for10min.at4C・4度2500g离心10分钟Resuspendcellsgentlyin20mloficecold"TB".小心用20mL预冷TB重悬细胞AddDMSOtoafinalconcentrationof7%.加入DMSO至终浓度7%Placeonicefor10minutes.置冰上10分钟Aliquotinto1-2mlandfreezeinliquidnitrogen.分装，液氮速冻Storeinliquidnitrogen.冻存SOBMediumandTB(TransformationBuffer)JM108感受态细胞的制备刚开始做实验时，是向TAKARA购买的，一支30元，定了10支。后来干脆自己做，感觉质量和TAKARA的质量不相上下，下面谈谈我制作感受态的体会。前期工作分子生物耗费时间在于准备过程太多。所以做好前期工作非常重要，所谓‘磨刀不误砍材功'。注意事项1•不要用经过多次转接或储于4C的培养菌，最好从一70°C或-20°C甘油保存的菌种划板（AMP阴性）37度过夜培养，划板时用小TIP头挑少许冰渣即可，轻划S行。同时记得设立对照：A、在AMP阳性板划菌，排出AMP抗性菌污染。大家都知道，实验室很多材料从师姐传师妹，或许经过很多人的转手。所以从头鉴定所用材料的可靠性非常必要。B、AMP阴性空白培基。系统控制参照，为更准确起见，用TIP头不沾任何东西进行划板。第二天挑克隆。2・质粒的质量和浓度:用于转化的质粒DNA应主要是超螺旋态DNA（cccDNA）。转化效率与外源DNA的浓度在一定范围内成正比，但当加入的外源DNA的量过多或体积过大时,转化效率就会降低。Ing的cccDNA即可使50“1的感受态细胞达到饱和。一般情况下,DNA溶液的体积不应超过感受态细胞体积的5%。不过我一般链接反应后（TAKARA的链接酶，体系25微升）会全量加到200微升的感受态里，约为150ng（载体0.1微克，目的片段约0.05微克）。效果也好。3・试剂的质量:所用的试剂，如CaC12等均需是最高纯度的（GR.或AR.）,并用超纯水配制，最好分装保存于干燥的冷暗处。国产的当然也可以。我用都是国产的，好像是陇西化学制剂，分析纯。4・防止杂菌和杂DNA的污染整个操作过程均应在无菌条件下进行，所用器皿,如离心管,tip头等最好是新的，并经高压灭菌处理，所有的试剂都要灭菌,且注意防止被其它试剂、DNA酶或杂DNA所污染，否则均会影响转化效率或杂DNA的转入，为以后的筛选、鉴定带来不必要的麻烦。培养基的配制1•配制LB-AMP抗性培养基LB液体培养基：精解蛋白胨10g，酵母抽提物5g，氯化钠10g,加去离子水800ml充分搅拌溶解，用Imol/LNaOH调pH7.0,补加去离子水至1000毫升，高压灭菌,4度保存。我一般没有用Imol/LNaOH调pH7.0。而是直接精解蛋白胨10g,酵母抽提物5g,氯化钠l0g加去离子水至1000ml。LB固体培养基：LB液体培养基中加1.5%琼脂粉，高压灭菌消毒；3・Amp母液：用无菌水或生理盐水配制成100mg/ml即100ug/ul溶液，置-20°C保存；AMP500mg/支，一支用5ml稀释即得。然后分5支分装（浓度100mg/ml即100ug/ul）。4•含Amp的LB固体培养基：将配好的LB液体培养基高压灭菌后冷却至60C左右，加入Amp储存液，使终浓度为100ug/ml摇匀后铺板（30ml/90mm）：即多少毫升培养基加多少微升上述的Amp母液多少毫升培基=加多少微升母液，或减半量则最终浓度为50ug/ml有指南上写细菌转化后37度复苏时用SOC培基。我从来只用AMP阴性的普通培基，效果也很好。5・0・05mol/LCaC12溶液:我们实验室只有CaCl2-6H2O,分子量219,配制100ml的，则需称量0.005x219=1.095g就可以了。其实氯化钙的摩尔浓度在0.05-0.1mol/L均可。溶于50ml重蒸水中,定容至100ml,高压灭菌。6•含15%甘油的0.05mol/LCaCl2:先配制成0.1mol/L的氯化钙溶液50ml,加入15ml甘油,定容至100ml,高压灭菌。有文献说要用0.22的滤器，其实完全没有必要。高压即可。准备工作做好了，就可以开工了。一、受体菌的培养从LB平板上挑取新活化的JM109单菌落，接种于3-10mlLB液体培养基中,37C下振荡培养12小时左右（一般过夜）。将该菌悬液以1:100-1:50的比例接种于10ml试管（如较多制备，多用几个试管即可）的LB液体（AMP阴性）培养基中同时做空的培基对照,37C振荡培养2-3小时至OD600=0.5左右。二、感受态细胞的制备（CaC12法）1、 将培养液分转入1.5ml的离心管中（一管10ml菌液可分装成约6管1.5ml的离心管中），冰上放置10分钟,然后于4°C下3000g离心10分钟。2、 弃去上清，用预冷的0.05mol/L