三维多孔聚乳酸聚羟乙酸共聚物plga及plurenic-f

三维多孔聚乳酸聚羟乙酸共聚物plga及plurenic-f

0新型骨软骨复合组织的构建关节软骨缺乏有效的分离和生长能力，损伤后的修复能力有限。组织技术的发展为解决这个问题提出了新思路。利用该技术已成功地构建了皮肤、肌腱等组织,并有相应的产品应用到临床。单纯组织工程软骨修复关节骨软骨缺损时,移植体与移植床的愈合界面是软骨-软骨、软骨-骨界面的整合,而这两种界面的整合较慢,移植体在移植床表面不稳定,可能导致修复失败。因此,目前很多研究倾向于研究构建组织工程骨与软骨复合物,旨在修复软骨下骨缺损的同时,使移植体在缺损区的整合固定界面由软骨-骨变为骨-骨界面,从而加快界面的愈合。国内王栋等研究证明骨髓基质干细胞(mesenchymalstemcells,MSCs)经向软骨细胞定向分化后复合PLGA支架材料,通过紧密压配方式与MSCs-PLGA支架在体内构建骨软骨复合体,可以有效修复骨软骨缺损。Gao等将大鼠干细胞诱导成软骨细胞后接种于透明质酸海绵,诱导为成骨细胞后接种于多孔磷酸钙陶瓷,然后用纤维蛋白陶瓷将两者粘结在一起,于裸鼠皮下进行培养,结果显示构建出了骨软骨复合组织。但以上方法均存在构建组织的骨软骨界面结合不佳的问题。而关节骨和软骨的界面结合强度不足将难以满足关节载荷的要求。本实验以软骨细胞和成骨细胞为种子细胞,以三维多孔聚乳酸/聚羟乙酸共聚物(poly(lactide-co-glyco-lide),PLGA)、Pluronic-F127水凝胶分别作为骨和软骨支架材料,体外构建组织工程骨软骨复合物,观察其在体内异位成骨软骨作用,旨在探讨构建组织工程骨软骨复合物的可行性,以期修复较大面积骨软骨复合缺损。1免疫组织化学设计:开放性实验。单位:中山大学附属第二医院骨科。材料:实验于2006-07/2007-04进行,细胞实验在中山大学附属第二医院医学研究中心实验室完成,动物实验在中山大学北校区实验动物中心完成。取2月龄新西兰大白兔,体质量不限,雌雄不限;SPF级4周龄裸鼠20只,体质量20g左右,雌雄不限。所有动物均由中山大学北校区实验动物中心提供,许可证号SCXK2004-0011。实验过程中动物处置符合动物伦理学标准。实验方法:软骨细胞的培养:2月龄新西兰大白兔以速眠新1支肌注麻醉,仰卧位,膝关节内侧切口,髌骨外侧脱位,暴露股骨内外侧髁,无菌切取膝关节软骨,于洁净工作台上PBS缓冲液冲洗并剪成约1mm3碎片,离心后先以0.25%的胰蛋白酶37℃消化30min,用PBS液冲洗1次。加入0.2%的Ⅱ型胶原酶,置于37℃恒温下消化8h,细胞悬液离心后用PBS冲洗1次,加入低糖DMEM培养液(含体积分数为0.1的胎牛血清,青、链霉素各100U/mL),调整细胞数目约2×108L-1接种于25cm2无菌培养瓶,置于37℃、体积分数为0.05的CO2培养箱内进行原代培养原代细胞。贴壁后,隔日更换培养基。原代细胞80%融合为单层后,继续进行传代培养。培养的第2代细胞作细胞爬片,冷丙酮固定30min,作II型胶原免疫组织化学染色。方法按免疫组织化学试剂盒说明操作进行。成骨细胞的培养:2月龄新西兰大白兔麻醉后,无菌条件下切取其双下肢胫骨骨外膜,标本经洗涤、剪碎后于搅拌状态下在0.25%胰蛋白酶中消化30min(37℃),再用0.1%胶原酶消化2h(37℃),取上清液,离心收集细胞。加入高糖DMEM培养液(含体积分数为0.15的胎牛血清,,青、链霉素各100U/mL),将获取的细胞悬液按2×108L-1细胞浓度接种到25cm2培养瓶中进行原代细胞培养。30%PluronicF-127凝胶的配制:取3gPluronicF-127,分次缓慢加入盛有10mLPBS的洁净玻璃瓶内,在4℃用振荡器持续振荡,直到白色絮状颗粒完全消失为止。经0.22μm滤膜过滤除菌后4℃保存备用。PLGA支架的预处理:将PLGA支架材料加工成10mm×6mm×4mm大小,用体积分数为0.75的乙醇处理48h,三蒸水处理36h洗去乙醇,去除三蒸水,在密闭环境中紫外线照射下干燥24h。以0.1%多聚赖氨酸包被支架12h,使用前泡入培养液中过夜预湿,常温干燥。组织工程软骨的体外构建:选用生长状态良好的第3代软骨细胞,培养的软骨细胞经质量分数为0.25%的胰蛋白酶消化后,用PBS缓冲液冲洗,1000r/min离心5min浓集。在4℃状态下将软骨细胞与PBS配制的PluronicF-127混匀,制成细胞凝胶复合物,使软骨细胞终浓度为5×1010L-1。组织工程骨的体外构建:将预处理的实验组PLGA支架置于24孔培养板中,每孔一块。选用生长状态良好的第4代成骨细胞,培养的成骨细胞经0.25%的胰蛋白酶消化后收集。用培养液配制成浓度为5×1010L-1的细胞悬液,以微量移液器缓慢滴加到干燥后的实验组PLGA表面,保持液滴不溢出支架表面;置于37℃,体积分数为0.05的CO2孵箱,静止培养4h使细胞悬液充分渗入到支架材料的孔隙内,后在支架周围小心加入培养液1mL,再于细胞培养箱中共同培养2d,使细胞在材料表面完全贴附。组织工程骨软骨的体外构建:取出培养2d的实验组成骨细胞-PLGA支架,在复合物的表面涂布薄层的负载软骨细胞的PluronicF-127水凝胶,厚约1mm。以单纯PLGA支架和单纯Pluronic-F127凝胶作为对照组。组织工程骨软骨的体内培养:将裸鼠20只3%戊巴比妥腹腔注射麻醉,无菌条件下于背部正中做长约1.5cm切口,切开背部皮肤及皮下组织,分别向切口两侧作一定皮下钝性分离,各组材料植入裸鼠背部皮下组织中,每只裸鼠均植入3块材料,切口左侧植入组织工程骨软骨复合物1枚,切口右侧植入单纯PLGA支架和单纯Pluronic-F127凝胶各1枚,见图1。术后用缝线严密缝合切口,体积分数为0.75的乙醇消毒切口后分笼饲养。组织工程骨软骨组织的观察:术后2个月处死实验裸鼠,解剖翻开背部皮肤,眼科小剪刀仔细分离材料周围的皮下组织。轻取出3组材料,大体标本观察后固定于40g/L的多聚甲醛中24h,行常规10%的EDTA(pH7.8~8.0)脱钙4周,两三天更换脱钙液,梯度乙醇脱水,二甲苯透明,石蜡包埋,制成5μm厚切片。切片行苏木精-伊红染色光镜下观察骨组织及软骨组织形成情况。主要观察指标:原代细胞形态学观察;复合物的大体形态学观察、苏木精-伊红染色观察及复合物免疫组织化学检测结果。2结果2.1动物的数量分析20只裸鼠中有1只因麻醉过度术后死亡,1只因皮肤切口破裂,复合物脱出退出实验,其余18只均进入结果分析。2.2成骨细胞和细胞的表达单层培养的软骨细胞呈短梭形。免疫组织化学染色可见细胞浆内棕褐色颗粒沉着,阳性颗粒出现在细胞浆、细胞膜和细胞间,细胞浆内表达Ⅱ型胶原,见图2a。成骨细胞以多角形细胞为主。细胞长满时相互间镶嵌排列,碱性磷酸酶染色见胞浆中有大量棕黑色颗粒,见图2b。2.3材料的厚度和组织力实验组组织工程骨软骨复合物:仍基本保持植入时的大小和形态,已看不到原有PLGA材料的乳白色。材料厚度较厚尚欠均匀,组织部分为白色,有弹性,为软骨组织。部分为暗红色,质地较硬,为骨组织,构建出的两种组织间有明显的界限。骨组织与软骨组织结合牢固,肉眼未见两者之间有间隙存在。单纯PLGA支架和单纯Pluronic-F127凝胶:2.4ga细胞的形态复合物植入后2个月光镜下见在暗红色的部分,可见有明显的成骨现象,新形成的骨组织连接成片块状或条索状,基质成分丰富,可见骨细胞位于骨陷窝中,PLGA已完全降解,在白色的部位已形成较成熟的软骨组织,细胞多,形态基本正常,分布较均匀。软骨细胞增殖成株状或岛状,可见同源软骨细胞簇,多位于软骨陷窝内。细胞周围有少量嗜碱性基质沉积。Pluronic-F127已完全吸收。软骨组织与骨组织的交界面处二者结合良好,部分区域可见软骨部分嵌入于骨组织中,但在局部某些区域,新形成的骨与软骨还未相互融合。组织学观察二者之间还有间隙。骨组织和软骨组织区域均未见明显炎细胞浸润及排斥反应。见图3。2.4胞浆及细胞周围基质的浅红色光镜下见II型胶原免疫组化染色呈阳性,细胞成圆形,形态饱满,胞浆丰富,可见胞浆及细胞周围基质浅红色至棕黄色染色,说明证明Ⅱ型胶原存在。3plurenicf-133支架材料的生物生态学特性和应用目前骨软骨复合组织构建研究在促进软骨与软骨下骨界面形成方面还有待于进一步完善。有文章报道骨软骨界面结合不佳是由于不同支架材料本身的物理特性(如支架的热膨胀系数,弹性性能等)。Sherwood等应用TheriForm三维打印方法研制出一种新型的骨软骨三维支架,在骨、软骨端配件交界区组成成分含量、气孔率等方面形成梯度变化,这样可以避免支架在体外培养和体内植入时发生界面分层而有利于新生的骨与软骨组织之间形成良好界面;但目前国际上尚没有统一的用于检测骨软骨界面结合力的量化标准,仅通过形态学观察评估界面的结合情况;另外体外以及体内实验所获得的骨软骨复合物的生物力学性能方面的特点也尚需进一步的研究。PLGA是一种生物相容性良好的可降解材料,是目前应用或研究最广泛的生物降解性可植入高分子材料,已被美国食品与药品管理局(FDA)批准用于医用支架和药物缓释载体。PLGA是乳酸和乙醇酸聚合而成,其结构和亲、疏水性可以通过两者的不同比例进行调节,进而决定支架材料在体内的机械性能和降解速率。目前很多研究已经证实该材料具有良好的安全性,被广泛应用与骨、软骨组织工程学研究;本实验通过调节PLA与PGA的比例75∶25,可以控制PLGA在体内8周降解,使其与骨组织再生率相匹配,在对照组见支架材料完全吸收,并对周围组织未造成影响,而实验组中骨细胞生长良好,保持骨细胞的生物学特性,表明了该材料的生物安全性,也显示了可降解材料的优越性。PluronicF-127支架材料在常温下为白色固体材料,在4℃可以溶解于水,形成无色液体,而在20%以上的浓度下室温条件下即可成为胶状物,可以利用此材料的温度敏感的特点直接用于注射或者涂抹与其他材料表面,其代谢产物可有人体完全排除体外,机体的反与弱于聚羟基乙酸或藻酸钙材料,在体内具有较高的安全性,也已经有研究证实PluronicF-127是一种软骨再生较为理想的支架材料。本实验也发现,其在体内可以完全降解,并未见对组织带来其他影响,而实验组中见软骨细胞生长良好,形成成熟的软骨组织,组织学形态良好。实验组骨软骨组织植入裸鼠皮下取材后发现手术区周围组织反应轻微,PLGA在8周组织切片观察到在材料降解的同时,伴随着显著的骨化现象,形成较成熟的板层骨组织。实验组软骨组织外观呈瓷白色,有弹性,类似于正常软骨组织。组织切片观察到较成熟的软骨组织形成,软骨细胞位于成熟的软骨陷窝中,新生软骨细胞呈圆形,细胞周围有少量碱性基质沉积,软骨陷窝较清楚,散在分布。免疫组化证实在形成的软骨基质中有被特异性染成棕黄色颗粒的Ⅱ型胶原分布,软骨陷窝周围明显,Ⅱ型胶原免疫组化染色阳性,以上表明本实验接种的细胞在Pluronic-F127凝胶中可以保持良好的形态和增殖及基质分泌能力,随着软骨细胞逐渐成熟并分泌大量基质,形成软骨陷窝,使软骨细胞包埋于其中。本实验在PLGA作为支架的组织工程骨并未观察到明显的炎症细胞浸润,虽然PLGA作为组织工程支架的缺点是易引起植入部位的炎症反应,但在本实验中并未观察到这一现象,原因可能有:(1)裸鼠为T淋巴细胞免疫缺陷的动物,对外来异体移植物一般不产生排斥反应。(2)Pluronic-F127凝胶涂抹在PLGA支架的表面,相当于将PLGA与周围部分隔离开来,减少了产生炎症反应的可能性。骨-软骨复合组织构建中的一个重要问题是骨和软骨的界面结合问题,本实验的结果表明,虽然