心力衰竭大鼠下丘脑室旁核内a1-r的改变及其对侧冠状动脉结扎术后神经机制的影响

心力衰竭大鼠下丘脑室旁核内a1-r的改变及其对侧冠状动脉结扎术后神经机制的影响

减少和进一步恶化钠胺，对chf的产生和发展起着重要作用。下丘脑室旁核是直接调控交感神经传出活动的重要中枢位点,CHF时室旁核神经元被激活,交感神经活动增强,是促进CHF发生发展的重要因素。中枢存在的血管紧张素1型受体(AT1-R)对心血管功能和交感神经活动的调节起到重要作用。本研究探讨CHF时下丘脑室旁核中AT1-R可能发生的改变对交感神经活动的影响及其在CHF发生发展机制中的作用。1材料和方法1.1给药及药物干预选取健康成年雄性SD大鼠,由山西医科大学实验动物中心提供,体质量230~250g。大鼠随机分为冠状动脉结扎术诱导的CHF组和假手术组,药物均为室旁核给药。假手术组给予空白对照药人工脑脊液,0.11μl/h。CHF组又随机给予AT1-R阻滞剂缬沙坦(VAL)进行干预(0.05μg/h)。每组动物12只,共36只。1.2心肌缺血模型制备实验大鼠经3%戊巴比妥钠(30mg/kg)腹腔注射麻醉后,头部固定在脑立体定位仪上,暴露颅骨,按照大鼠脑图谱定位室旁核,坐标为:前囟后1.8mm,左右0.2mm,颅骨下7.9mm。用小钻头穿透颅骨进行插管,将带芯的外径0.5mm、内径0.2mm的不锈钢管插至室旁核,用牙脱粉颅外固定。1.3制备大鼠CHF模型:室旁核插管术后1周,麻醉大鼠,经口腔气管插管机械通气。记录标准Ⅱ导联心电图。无菌条件下开胸,暴露心脏。结扎左冠状动脉前降支(假手术组只穿线不结扎)。结扎后左心室壁颜色变暗或苍白,心电图S-T段有典型缺血性表现。随后逐层闭合胸腔,常规碘伏消毒。大鼠自主呼吸恢复后,拔除气管插管。术后消炎治疗3d。1.4内芯内芯内芯的内压内固定术冠状动脉结扎术后,大鼠俯卧位,切开颈背部皮肤,拔除室旁核插管的内芯,将外径0.2mm的不锈钢管插入室旁核插管并与其一同固定,再通过PE管与充满各种药液的微型渗透压泵相连,埋于颈背部皮下,缝合局部皮肤。术后大鼠分笼常规饲养,观察一般状况。1.5chf模型成功标志大鼠术后4周进行超声心动图检查,由资深专业技师进行操作。大鼠麻醉后仰卧位固定,胸部备皮,超声心动图监测大鼠的左室射血分数(LVEF)。LVEF<0.35为CHF模型成功标志。1.6血流动力学和肾交感神经放电活动测定:大鼠术后4周,麻醉后仰卧位固定,无菌条件下,行右侧颈总动脉插管,管内充满0.25%肝素生理盐水抗凝,插管逆行进入左心室,记录心率(HR)、左心室舒张末压(LVEDP)和左心室内压力最大上升或下降速率(±dp/dtmax)等。LVEDP≥2kPa(15mmHg)为CHF模型成功标志。之后,于左侧腹侧部肋下切口,暴露腹膜后肾脏,玻璃分针分离肾交感神经,将肾交感神经浸于37℃石蜡油中,搭于一对银记录电极上,电生理记录仪记录其放电活动。1.7提取心脏和肺等组织,分离右心室大鼠开腹后腹主动脉采血,血浆留存于-80℃冰箱。同时,冰上迅速摘取心脏和肺等组织,漓干称质量,分离右心室,室间隔留于右心室,称质量。断头取脑,采集下丘脑标本,-80℃冰箱保存。1.8酶联免疫吸附试验elisa取各实验组大鼠血浆。严格按照ELISA试剂盒说明步骤操作,检测各实验组大鼠血浆中AngⅡ和NE的含量。最后通过酶标仪读取结果。1.9pvdf膜的制备提取脑组织样品蛋白,确定上样量,100℃加热使蛋白质变性。使用10%分离胶进行聚丙烯酰胺凝胶电泳、转膜、5%小牛血清封闭、加入TBST稀释的兔抗大鼠Fra-like(1∶200)或AT1-R(1∶200),4℃过夜,使抗原抗体充分结合。再加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔IgG,37℃条件下孵育2h。最后加入化学发光底物,显影定影,X线底片曝光记录。曝光后在PVDF膜还未干燥前用100mmol/L巯基乙醇,2%SDS,62.5mmol/LTrisHCl,pH6.7的缓冲液室温下漂洗PVDF膜,随后加入β-Actin一抗(1∶1000)按上述步骤检测内参Actin的表达情况。之后进行图像分析和统计学处理,所拍胶片用KODAKDigitalScience1D软件分别计算Fra-like、AT1-R和β-actin各曝光条带的面积和灰度的乘积,并计算出Fra-like和AT1-R指标对应曝光条带所得乘积与β-actin条带所得乘积的比值。1.10统计评估所有实验数据均采用SPSS13.0软件进行统计学分析,实验数据用表示,采用t检验,以P<0.05为差异有统计学意义。2结果2.1一般情况CHF组大鼠与假手术组比较,食欲较差,体质量增加缓慢,毛色晦暗无光泽,精神差,反应迟钝。2.2动脉粘结线下的心肌梗死术后4周,开胸肉眼观察CHF组大鼠在冠状动脉结扎线下方的心肌梗死区心肌被白色菲薄的结缔组织代替,室壁变薄,左室心腔扩大,非梗死区室壁增厚;假手术组大鼠心脏无异常。2.3左心室内压变化CHF组大鼠LVEDP和HR均明显高于假手术组(P<0.05);CHF大鼠室旁核内给予VAL后LVEDP明显下降,但是仍高于假手术组(P<0.05)。CHF组大鼠左心室内压最大上升或下降速率(±dp/dtmax)均明显低于假手术组大鼠(P<0.05);CHF大鼠室旁核内给予VAL后±dp/dtmax明显上升,但是仍然明显低于假手术组(P<0.05)。见表1。2.4室旁核内给药对大鼠肾神经放电的影响与假手术组比较,冠状动脉结扎术后4周CHF组大鼠肾交感神经活动显著增加(P<0.05);心衰大鼠室旁核内给予VAL治疗后肾交感神经放电活动明显减少,但是仍然高于假手术组(P<0.05)。CHF组大鼠在冠状动脉结扎4周后,LVEF显著低于假手术组(P<0.05);CHF大鼠室旁核内给予VAL治疗后LVEF略有上升,但无明显改善。见表2。2.5室旁核内给予val的l/bw比值CHF组大鼠的RV/BW和L/BW比值显著高于假手术组(P<0.05);CHF大鼠室旁核内给予VAL后L/BW比值显著下降(P<0.05);RV/BW比值有所下降(P>0.05),但仍显著高于假手术组。见表3。2.6假手术组的比较CHF组大鼠血浆内NE和AngⅡ含量均显著高于假手术组(P<0.05);CHF大鼠室旁核内给予VAL治疗后血浆内NE和AngⅡ含量均显著下降(P<0.05),但仍显著高于假手术组。见表4。2.7假手术组与e和at1-r蛋白含量的比较CHF组大鼠与假手术组相比,室旁核内Fra-like和AT1-R蛋白含量均明显高于假手术组(P<0.05);CHF大鼠室旁核内给予VAL干预后Fra-like和AT1-R蛋白含量均明显下降(P<0.05)。3室旁核和肾素-血管紧张素本研究发现CHF时大鼠室旁核神经元兴奋性增加,室旁核内Fra-like和AT1-R蛋白表达增多,并伴有外周交感神经活动增强;大鼠室旁核内长期持续微量注入AT1-R阻滞剂缬沙坦治疗后则使CHF大鼠室旁核Fra-like和AT1-R表达减少,外周交感神经活动减弱。提示CHF时室旁核内AT1-R被明显激活,使室旁核神经元兴奋性增加,进而使交感神经活动增强,促进CHF的发生发展。CHF是由各种心血管疾病引起心输出量降低并伴有心功能进行性恶化的临床综合征。是多种心血管疾病的主要并发症,其中冠状动脉性疾病是CHF最主要的病因。持续的交感神经过度激活是CHF的重要特征,贯穿了CHF发生与发展的整个过程,也是CHF发病率和病死率不断增加,造成患者心功能恶化及猝死的重要原因。因此抑制交感神经系统过度激活是CHF治疗的关键。临床治疗中使用β-肾上腺素能受体阻滞剂对抗CHF时增加了的交感神经活性,可以明显改善CHF患者的预后,但是并不能完全消除CHF时交感神经过度激活的状态。随着基础研究的不断深入,许多学者认识到中枢调控机制的改变可以使CHF时存在的交感神经激活、心功能下降和水钠潴留进一步恶化,并且交感神经中枢的激活是构成CHF病理机制的重要因素。因此,对CHF的研究开始转向中枢神经系统。正常情况下,脊髓交感神经节前神经元的活动完全受下丘脑室旁核(PVN)和延髓头端腹外侧区等心血管中枢的控制。室旁核是直接调控交感神经传出活动最主要的中枢位点。研究发现刺激正常大鼠室旁核神经元不仅导致大鼠的血压升高、肾交感神经放电活动增强,还可以引起心肌收缩力增强,心率增快,心肌耗氧量增加。而CHF时,交感神经放电活动增强的同时,室旁核神经元被激活。针对室旁核在CHF机制中的重要作用,许多学者把它作为CHF药物治疗的新靶点进行了一系列试验,证实CHF时脑内神经内分泌机制的改变可能是诱发CHF时交感神经传出增加的重要因素对CHF的发生发展具有重要作用。肾素-血管紧张素系统(RAS)是人体重要的体液调节系统,主要通过AngⅡ与AT1-R结合发挥作用。CHF时外周RAS被激活,血浆AngⅡ增加,促进血管收缩、水钠潴留,心室重构和交感神经活动持续加强,最终导致心功能不断减退。目前对于CHF时脑内RAS是如何促进交感神经活动的确切机制还不清楚。Francis等研究证实,将脑内血管紧张素原缺陷的转基因鼠经冠脉结扎制作成CHF模型后,交感神经激活及心室重构现象都较SD心力衰竭大鼠明显减轻,提示CHF时脑内RAS可能参与了CHF的发生发展。在脑内RAS各成分均有表达。并且在心血管中枢下丘脑室旁核等区域不仅有RAS各成分的表达,而且室旁核中含有含量最为丰富的血管紧张素转换酶和AT1-R的存在。脑内产生的AngⅡ具有升高血压,促进精氨酸加压素释放,降低机体压力感受性反射的敏感性,促进交感神经激活等功能。下丘脑室旁核区域的RAS是调节交感神经活动的重要体液因素。AT1-R被证明是介导中枢血管紧张素作用的最重要的受体,脑内AngⅡ主要通过与AT1-R结合发挥作用。免疫组织化学研究证实,在室旁核、孤束核和延髓头端腹外侧区等自主神经中枢均有AT1-R的表达,将AngⅡ注入这些脑区均可使血压升高。而给正常大鼠室旁核区域注入AngⅡ不仅使室旁核内AT1-R和Fra-like阳性神经元数量增加,产生明显的升压反应,而且还可以通过作用于其中高密度的AT1-R,明显增强交感神经传出活动,降低机体压力感受性反射的敏感性。机体在不同状态时室旁核中的AT1-R可以发生上调或下调。本研究发现,与正常大鼠比较,经冠状动脉结扎术诱导的CHF大鼠下丘脑室旁核神经元兴奋性增加,室旁核内AT1-R表达增多,外周交感神经活动增强。而室旁核内长期持续微量注入AT1-R阻滞剂缬沙坦则使室旁核AT1-R表达减少,外周交感神经活动减弱。进一步说明室旁核局部AT1-R表达增多、功能上调与CHF时交感神经的过度激活有关,对心血管功能具有重要的调节作用。同样有研究证实如果长期侧脑室内给予AT1-R阻滞剂氯沙坦阻断AngⅡ对脑的作用,不仅使下丘脑室旁核区域AT1-R表达下降,降低交感神经活动,并且可以使CHF时钠水潴留、左室舒张末期容积及左室重构均明显减轻。本研究还证实,CHF时,大鼠血浆AngⅡ和NE含量升高、左室舒张末期容积和压力明显增加,心功能明显下降,外周交感神经活动增强。PVN内注入AT1-R阻滞剂VAL治疗则一方面使大鼠血浆AngⅡ和NE含量下降,同时使大鼠的心功能得到明显改善。更加明确提示CHF时交感神经激活不仅仅是血浆AngⅡ升高或脑室内RAS激活造成的全身或全脑反应,而且室旁核内部RAS激活,AT1-R表达增加是CHF时交感神经激活和心功能恶化的重要因素。在临床工作中,CHF患者长期使用