鸡脑ghrelin免疫反应阳性神经元发育性变化规律的研究

鸡脑ghrelin免疫反应阳性神经元发育性变化规律的研究

1999年，kojima等人从大鼠胃组织中分离并提取了28个氨基酸残基，这是由激素分泌功能障碍（ghsr）引起的内源性配体，并被称为ghrelin。研究表明,Ghrelin具有多种生物学功能,如刺激腺垂体释放GH;刺激促肾上腺皮质激素、氢化可的松、儿茶酚胺和催乳素的释放;调节胃肠道的生理功能,促进哺乳动物摄食;调节能量平衡;调节胰腺内分泌;促进脂肪沉积;增强记忆;改善神经系统发生;改善心血管功能;调节卵巢和睾丸的功能;参与免疫调节等。关于Ghrelin调节动物的摄食活动,以往在哺乳类研究较多,但在禽类研究较少。Nakazato等给小鼠静脉和脑室内注射外源性Ghrelin,结果引起明显的剂量相关的采食量增加,体质量也相应增加,而能量消耗减少。Murakami等用抗血清处理大鼠,发现能够显著降低日采食量和体质量。Salfen等发现,猪禁食后血清Ghrelin浓度增加,当给予食物后,其浓度又恢复到原来的水平。他们认为,Ghrelin促进摄食是通过NPY、AGRP和Orexin等具有较强刺激食欲作用的物质的表达而实现的。以往有关神经系统的Ghrelin形态学研究较少,并且结果不尽一致。Kojima等应用免疫组织化学方法,发现Ghrelin免疫阳性反应除分布于胃泌酸腺外,还分布于下丘脑弓状核内;Kaiya等应用RT-PCR方法,发现Ghrelin除在腺胃中有高水平表达外,大脑纹状体有中度表达,小脑、视神经叶、脑干等有低水平表达。但Ahmed等在下丘脑弓状核中没有观察到Ghrelin免疫阳性反应,而在内侧核、视交叉上核、视前内侧核、视前上核观察到Ghrelin免疫反应阳性细胞。本试验应用免疫组织化学方法和显微图像分析技术,对岭南黄鸡脑Ghrelin免疫反应阳性神经元的定位分布、下丘脑Ghrelin免疫反应阳性神经元的发育性变化规律及禁食对其影响进行研究,旨在为揭示鸡Ghrelin的生理功能及其作用机制提供形态学资料。1材料和方法1.1试验动物、样品的采集和组织的准备1.1.1组织切片制备2、16、30、44、58日龄眼观健康的岭南黄鸡各5只,断头处死,小心剥去颅骨,立即取出完整脑部,0.75%生理盐水冲洗后,放入4%多聚甲醛中固定30min,然后修整组织块,切取大脑、间脑、中脑、脑桥、延髓、小脑重新放入上述固定液中再固定24h,按常规方法制成石蜡连续切片,片厚6μm,切5张取1张。另取5只30日龄的鸡脑,液氮中速冻30s,然后置于-80℃低温冰箱保存,制成连续冰冻切片,片厚10μm,切3张取1张。1.1.2摄食情况s0h30日龄的上述鸡45只,分为3组:①禁食组,分别禁食12h(S12h)、24h(S24h)、48h(S48h)各5只。②禁食后重新采食组,分别禁食12h重新采食4h(S12h+RF4h)、禁食24h重新采食4h(S24h+RF4h)、禁食48h重新采食4h(S48h+RF4h)各5只。禁食时正常供应水。③对照组,自由采食和饮水12h(S0h+12h)、24h(S0h+24h)、48h(S0h+48h)各5只。各组鸡至规定时间后,按上述方法将其下丘脑制成石蜡连续切片。1.2抗显色试验兔抗鼠Ghrelin抗体(康肽生物科技有限公司,批号H-031-31);二抗显色试剂盒(LABVISIONA公司);APES涂片剂(Sigma公司);尼氏(Nissl)染色液(Sigma公司)。1.3elin免疫反应阳性神经元定位石蜡切片和冰冻切片常规Nissl染色,对鸡脑各神经核团进行定位,作为神经核团Ghrelin免疫反应阳性神经元定位的参照。步骤如下:石蜡切片经二甲苯脱蜡,梯度酒精复水(冰冻切片,不经此步骤);Nissl染色液在暗室室温下染色1h;双蒸水洗2次;95%酒精分色30s;无水酒精洗涤数次;二甲苯充分洗涤;中性树胶封片;光镜观察和照相。1.4小鼠grt-1,ph值4.石蜡切片或冰冻切片粘贴在经APES处理的防脱玻片上;二甲苯脱蜡,梯度酒精复水(冰冻切片,不经此步骤);甲醇配制的0.3%H2O2阻断液中室温孵育10min;PBS(0.01mol·L-1,pH7.2。下同)洗涤5min×3;滴加正常血清封闭液,室温下孵育7min;PBS略洗;滴加1∶1000兔抗鼠Ghrelin血清(一抗),37℃,湿盒内孵育2h;PBS洗涤5min×3;滴加生物素结合的羊抗兔IgG抗体(二抗),37℃,湿盒内孵育1h;PBS洗涤5min×3;滴加链霉素抗生物素结合的过氧化物酶,37℃,湿盒内孵育30min;PBS洗涤5min×3;滴加DAB(二氨基联苯胺),孵育30min;PBS洗涤5min;苏木精复染细胞核、脱水、透明、中性树胶封固,光镜观察和照相。阴性对照以PBS代替一抗,其他步骤同上。1.5观察记录和分析指标应用BH-2Olympus显微镜,在10×60放大倍数下,在每个年龄组每只鸡下丘脑的弓状核、室旁核、内侧核、室周区、外侧区、内侧区(包括弓状核、室旁核、内侧核),各随机选取5个不同视野观察记录和数码拍照。应用JD801形态学图像分析系统,分析每个年龄组每只鸡下丘脑各个神经核团Ghrelin免疫反应阳性神经元的灰度值。灰质值分为256级,从0～255,0为最深,表示阳性反应最强,255为最浅,表示阳性反应最弱。并用此分析系统计算鸡Ghrelin免疫反应阳性神经元在下丘脑各神经核团中的数目(P)。1.6grtelin免疫反应阳性神经元平均粒度值的差异根据图像分析得出的Ghrelin免疫反应阳性神经元灰度值,用SPSS14.0数据统计分析软件中的单因素方差分析法(ANOVA)中的L-S-D分析测试各个年龄组鸡下丘脑各个神经核团Ghrelin免疫反应阳性神经元平均灰度值之间的差异性。根据图像分析得出的Ghrelin免疫反应阳性神经元数目(P),计算出每个年龄组鸡下丘脑各个神经核团Ghrelin免疫反应阳性神经元的密度(即单位面积的数目),公式为:D=P/A(A为测面面积,A=1.733mm2),并用SPSS14.0数据统计分析软件中的单因素方差分析法(ANOVA)中的L-S-D分析测试各个年龄组鸡下丘脑各个神经核团Ghrelin免疫反应阳性神经元平均密度之间的差异性。2结果与分析2.1神经元的结构尼氏体(Nisslbodies)是神经元的特征性结构之一,存在于神经元胞体和树突内。Nissl染色可以清晰地显示鸡脑显微结构和区别各种神经核团。2.2免疫反应阳性神经元/阳性反应鸡脑免疫组织化学染色切片,背景无色或浅黄色。Ghrelin免疫阳性反应为棕褐色或棕黄色,主要分布于神经元胞体的细胞质中,突起中散在分布,细胞核内反应较弱或无反应。阴性对照不显示免疫阳性反应,细胞核由于苏木精的复染呈蓝色,细胞质无色。在下丘脑弓状核、室旁核、内侧核、室周区、外侧区、内侧区,丘脑卵圆核、圆核,中脑丘中央灰质层、红核,脑桥前庭腹外侧核,小脑内侧核等神经核团,以及小脑皮质颗粒层、大脑皮质多形细胞层等,均可观察到Ghrelin免疫反应阳性神经元(图1)。下丘脑弓状核(PVA)的细胞大小不一,形态多样,呈圆形、梭形或不规则形,排列较密集;Ghrelin免疫反应阳性神经元较多,阳性反应主要见于胞质中,胞核中无反应或反应弱(图1a～c)。室旁核(PM)的细胞亦大小不等,形态多样,排列较密集;Ghrelin免疫反应阳性神经元亦较多,阳性反应主要见于胞质中(图1d)。室周区(PVHT)包括室周腹侧核、室周小细胞核、室周大细胞核,细胞多为圆形,排列较疏松;Ghrelin免疫阳性反应主要见于胞质中,有的胞核中亦可见阳性反应(图1e)。内侧核(MHT)的细胞亦大小不一,形态多样,以中小型细胞为主,排列稍疏松;Ghrelin免疫反应阳性神经元亦较多,阳性反应主要见于胞质中(图1f)。内侧区(RMH)的细胞亦大小不等,形态多样,以中小型、梭形和圆形为主,排列较密集;Ghrelin免疫反应阳性神经元亦较多,阳性反应主要见于胞质中(图1g)。外侧区(RLH)的细胞排列亦较疏松,以中小型、梭形和圆形为主;Ghrelin免疫阳性反应主要见于胞质中(图1h)。小脑内侧核(CBM)的细胞大小不等,圆形或锥体形,排列疏松;Ghrelin免疫阳性反应主要见于胞质中(图1l)。丘脑卵圆核(Ov)的细胞较小,圆形或卵圆形,Ghrelin免疫反应阳性神经元较少,阳性反应主要见于胞质中。丘脑圆核(Ro)的细胞较大,呈圆形或椭圆形,排列较疏松,Ghrelin免疫阳性反应主要见于胞质中(图1i)。中脑红核(Ru)的细胞较大,圆形、椭圆形或锥体形,排列较疏松;Ghrelin免疫阳性反应主要见于胞质中,有的胞核亦呈阳性反应(图1j)。中脑丘中央灰质层(SGC)的细胞较少,大小不一,锥体形或不规则形,排列疏松;Ghrelin免疫阳性反应见于胞质和胞核中(图1k)。脑桥前庭腹外侧核(VeVL)、小脑皮质颗粒层(CGL)的Ghrelin免疫反应阳性细胞较少,胞体较大,椭圆形或锥体形,阳性反应主要见于胞质中(图1m)。大脑皮质多形细胞层(CPL)的Ghrelin免疫反应阳性神经元大小不一,圆形或梭形居多,另有少量锥体形细胞,阳性反应主要见于胞质中(图1n～o)。2.3免疫反应强度不同日龄鸡下丘脑各神经核团表达Ghrelin的情况,经显微图像分析,结果见表1。从表1可以看出,随着日龄的增长,下丘脑各神经核团Ghrelin免疫反应阳性神经元的灰度值下降,即免疫反应强度(Ghrelin表达量)升高。从相同日龄分析,其免疫反应强度,2d室周区(PVHT)较强,弓状核(PVA)、室旁核(PM)、外侧区(RLH)、内侧区(RMH)次之,内侧核(MHT)较弱;16d弓状核、室旁核较强,室周区次之,内侧核、内侧区、外侧区较弱;30d弓状核、室旁核、室周区较强,内侧核、外侧区次之,内侧区较弱;44d室旁核较强,弓状核、内侧核、室周区、外侧区、内侧区略弱;58d内侧核较强,弓状核、室旁核、室周区、内侧区次之,外侧区较弱。说明在相同日龄,下丘脑各神经核团分泌的Ghrelin量是不同的。2.4细胞密度和日龄组的密度不同日龄鸡下丘脑各神经核团Ghrelin免疫反应阳性神经元的密度见表2。从表2可以看出,不同日龄鸡下丘脑各神经核团Ghrelin免疫反应阳性神经元的密度,2d最大,16d明显下降,之后30、44、58d又有所回升。从相同日龄分析,其细胞密度,2d弓状核最大,外侧区、内侧核次之,内侧区、室旁核、室周区较低;16d内侧核最大,外侧区、内侧区、弓状核次之,室旁核、室周区较低;30d室周区最大,内侧核、弓状核次之,内侧区、外侧区、室旁核较低;44d内侧核最大,外侧区、室周区次之,弓状核、室旁核、内侧区较低;58d内侧核、外侧区最大,弓状核次之,室周区、室旁核、内侧区较低。2.5s0h+12h从表3可以看出,下丘脑Ghrelin免疫反应阳性神经元的灰度值,S12h、S12h+RF4h与S0h+12h相比有所升高;S24h、S24h+RF4h与S0h+24h相比也有所升高;而S48h、S48h+RF4h均显著高于S0h+48h。表明禁食时下丘脑主要神经核团Ghrelin免疫反应阳性神经元的反应强度(Ghrelin表达量)下降,而且禁食时间越长,表现越明显。2.6s12h+rf4h从表4可以看出,下丘脑Ghrelin免疫反应阳性神经元的密度,S12h比S0h+12h有所下降,S12h+RF4h显著低于S0h+12h;S24h、S24h+RF4h比S0h+24h亦有所下降;而S48h、S48h+RF4h则极显著或显著低于S0h+48h。表明禁食时下丘脑主要神经核团Ghrelin免疫反应阳性神经元的密度下降,而且禁食时间越长,表现越明显。3讨论3.1鸡脏器grt-pcr检测gearelin表达下丘脑结构复杂,调控着机体多种重要的机能活动。弓状核能够产生多种神经递质及肽类物质,参与调节神经内分泌、多种代谢过程和复杂的行为活动。室旁核含有神经内分泌细胞,是调节神经内分泌功能和心血管活动的高级中枢,而且室旁核含有胃动素,参与胃酸分泌和胃肠活动的调节,是影响消化道功能的重要中枢部分。同时,下丘脑是摄食调节中枢,其内存在着由弓状核、室旁核、内侧核、背内侧核、视交叉上核和外侧区等组成的“食欲调节网络”:外侧区是摄食中枢,内侧核是饱食中枢,促进摄食的AGRP/NPY、Orexin和抑制食欲的Leptin、CCK、α-MSH/POMC、PYY等存在于该调节网络中。内侧核、外侧区还与室旁核、海马、杏仁核等一起参与胃肠运动的中枢调节,并对水平衡有调节作用。本试验表明,鸡下丘脑弓状核、室旁核、内侧核、外侧区均显示Ghrelin免疫阳性反应。提示Ghrelin阳性神经元可能作用于分泌NPY、AGRP、Leptin、CCK、α-MSH/POMC、PYY等激素的神经元,达到刺激采食或抑制采食以及调节其他生理机能的目的。Ahmed等研究表明,弓状核、腹内侧核、视交叉上核、视前内侧核、视前上核中存在Ghrelin免疫阳性反应,并且Ghrelin阳性神经元的纤维一直延伸到正中隆起,因此推测Ghrelin参与摄食调节可能是通过弓状核的AGRP/NPY神经元途径来实现的,或者Ghrelin阳性神经元的纤维进入垂体,通过门脉循环刺激垂体释放GH。由于弓状核接受来自视前内侧区、视交叉上核、室周核以及下丘脑前区、杏仁核、嗅结节的纤维等,而室旁核接受来自内侧核、弓状核等的纤维,因此弓状核中Ghrelin阳性神经元的纤维可能经室旁核至垂体或直接至垂体,同时也可能是室旁核中Ghrelin阳性神经元的纤维直接至垂体,从而调节垂体的功能。本试验还表明,鸡下丘脑室周区、内侧区也显示Ghrelin免疫阳性反应。室周区含有SS细胞在内的多种调节垂体激素合成的细胞,与弓状核一起合成和分泌多种激素释放因子或抑制因子,通过结节漏斗束投射到垂体门脉系统,调控腺垂体的内分泌功能。下丘脑内侧区有内侧核、背内侧核、结节核与灰白结节、弓状核和结节乳头核等神经核团,在神经内分泌调节中起重要作用。Ghrelin阳性神经元在这些区域中存在,提示Ghrelin参与神经内分泌的调节。本试验还发现,丘脑卵圆核、圆核,中脑丘中央灰质层、红核,脑桥前庭腹外侧核,小脑内侧核等神经核团,以及小脑皮质颗粒层、大脑皮质多形细胞层等,也可观察到Ghrelin免疫反应阳性神经元。Kaiya等用RT-PCR方法证实,大脑纹状体有中度的GhrelinmRNA表达,小脑、视神经叶、脑干有低水平的GhrelinmRNA表达。提示Ghrelin可能在调节感觉冲动、躯体运动、肌紧张、听觉等方面也有作用。3.2鸡腺胃grt-pcr检测本试验表明,2d时下丘脑主要神经核团的Ghrelin免疫阳性反应最弱,随着日龄的增长,阳性反应逐渐增强;但各神经核团Ghre