催乳素释放多肽的原核表达及细胞免疫组化

催乳素释放多肽的原核表达及细胞免疫组化

产乳酶的释放是牛奶中的一种亲水活性物质。RF多肽在C端含有Arg-Phe-NH2的共同结构,于1977年首先在无脊椎动物中发现,随后很多的无脊椎动物RF肽被发现和确定,它们具有很多的生物活性。然而,有关脊椎动物RF肽的研究非常有限,最近几年只有少量的脊椎动物RF肽被确定。最近研究的热点是从两栖动物脑中分离的2个RF肽:RanaRFamide(R-RFa)和26RFa。至今确定的哺乳动物RF多肽包括神经肽FF(NPFF)、神经肽AF(NPAF)、PrRP、RF多肽相关多肽(PFRPs)等。NPFF和NPAF是1985年首先报道的2个哺乳类RF多肽。然而很多年后,再没有新的哺乳类RF多肽的报道。直到1998年,HinumaS等分离得到了编码人G蛋白耦联受体(hGR3或UHR1或GPR10)的互补DNA,hGR3受体只在人垂体特异性表达。进一步研究发现,在牛下丘脑存在hGR3受体的配体,是一种与其他已知多肽和蛋白没有相似序列的多肽,它能够有效地促进大鼠垂体前叶细胞释放催乳素,于是被命名为催乳素释放多肽(PrRP)。PrRP基因在1998年首先克隆,由cDNA编码的前催乳素释放肽原至少能衍生2种PrRP异构体:PrRP31和PrRP20。1prrp在神经纤维分布的研究细胞免疫化学方法显示在大鼠下丘脑室旁核、视上核、丘脑带旁核、杏仁基底外侧核、终纹床核都有高密度的PrRP免疫反应性神经纤维网的存在,同时在神经垂体中也含有少量的PrRP神经纤维。然而,PrRP不同于其它的下丘脑释放激素,在正中隆起的外部区域,即释放经典下丘脑激素的部位,并没有发现PrRP免疫反应性细胞。PrRP免疫反应性细胞大多分布于下丘脑背内侧核和孤束核的尾部,同时PrRP能神经元体及末梢在前脑和脑干中分布较广。YanoT等运用原位杂交和免疫组化技术探讨了不同发育时期大鼠脑中PrRP的表达,发现PrRP神经纤维起源于延髓,在大鼠的早期发育中,在脑中分布较广泛。发育18d的胎儿孤束核(NTS)中开始有PrRPmRNA的表达。发育20d的胎儿在延髓尾部网状核的侧部和腹部有PrRPmRNA的表达。出生后13d,下丘脑开始有PrRPmRNA的表达。运用RT-PCR技术,从发育18d胎儿的延髓和出生后13d幼鼠的下丘脑中检出PCR的产物,是一条268bp的链。用抗PrRP前提物的单克隆抗体免疫检测发现在发育18d胎儿孤束核、发育20d胎儿网状核的腹侧部、出生后13d的下丘脑背内侧核部位中检测到了染色较深的细胞。利用抗成熟PrRP的单克隆抗体,同时利用免疫组化方法,检测了出生后6d的大鼠PrRP在神经纤维脑中的分布。PrRP神经纤维分布在下丘脑室旁核、下丘脑室周核、视前内侧核、杏仁体基底外侧部、下丘脑背内侧核、下丘脑腹内侧核、丘脑室周核和终纹床核,这和成年大鼠中的分布类似。出生6和9d,视交叉中部、网状核腹侧尾部也有PrRP神经纤维的存在,而成年鼠中上述部位却没有分布。MaruyamaM等研究发现动情周期活动并不影响大鼠PrRP的分布。绵羊PrRP和大鼠PrRP一样在脑干中的表达比在下丘脑中的表达丰富。然而,在绵羊的下丘脑中PrRPmRNA的表达比大鼠下丘脑中的表达更加广泛,主要在下丘脑正中基底的尾部和腹边缘部有PrRP的表达。2prrp受体mrna的转录表达PrRP受体含有7个跨膜域的G蛋白耦联受体。IbataY等利用运用定量RT-PCR发现了PrRP受体。进一步利用原位分子杂交和组化技术发现在大鼠垂体前叶、居间小叶和脑中的许多地方有PrRP受体mRNA的表达,但在垂体后叶中并没有发现此受体的表达。PrRP及其受体的表达并不完全一致。下丘脑中的很多地方都有PrRP受体的转录,但PrRPmRNA的表达局限于下丘脑的背内侧核腹部,在下丘脑神经内分泌核区并没有发现PrRPmRNA的表达。同时在丘脑网状核PrRP受体mRNA表达强烈,但却没有PrRP神经元体和末梢的分布。原位杂交组化和Northern印迹分析表明,雌性大鼠中的PrRP受体转录表达水平高于雄性大鼠,但泌乳大鼠和非泌乳大鼠之间没有显著差异。SatohF等报道大鼠PrRP结合位点存在于脑(下丘脑、延髓、小脑)、垂体、心脏、比目鱼肌脂肪组织、肾、肾上腺、睾丸、小肠组织细胞膜上面。竞争结合试验表明:在下丘脑、垂体、心脏、比目鱼肌中结合位点各自具有自己的特异性。在大鼠的心肌和骨骼肌组织中可能含有不同于UHR-1的其他PrRP受体。3神经肽对prrp表达的影响大鼠垂体前叶细胞对PrRP的亲和性受生理机制的调控。不同生育时期雌性大鼠的垂体前叶细胞对PrRP的敏感性不同,其中采自泌乳大鼠的垂体细胞,相比于妊娠和其他任意时期的垂体细胞,对PrRP的亲和性最大。它反映了不同的生育时期,垂体前叶细胞的活动情况不一样,其中可能是PrRP受体mRNA的表达水平不一样。此外,雌激素处理雄性大鼠,能使其垂体细胞对PrRP的亲和性增加。性别差异研究方面表明:雌性大鼠,特别是发情前期的雌性大鼠比雄性大鼠对PrRP更敏感。RF肽在对NPFF受体的结合上有相对较低的分辨性,人PrRP31和NPFF2神经肽受体亚型2结合后,其作用显著高于NPFF和它的类似物,从而人PrRP可能通过NPFF受体进行信号传导。而NPFF和它的类似物对人PrRP受体无效。4ri的生物学效果4.1prrp对大鼠血浆中prl的影响PrRP和TRH一样能促进离体培养的雌性大鼠垂体细胞prl的分泌,并且PrRP的作用比较专一。但在不同生育时期,雌性大鼠的垂体前叶细胞对PrRP的敏感性不同,其中泌乳大鼠的垂体细胞,与妊娠期和其他时期大鼠的垂体细胞相比,对PrRP的敏感性最大。10、100nmolPrRP可以促进成年雄性大鼠垂体细胞培养物prl的分泌,并呈剂量依赖性关系,而0.1和1nmolPrRP则抑制prl的分泌。其促进和抑制效果受其他激素的影响。地塞米松降低促进效应的最高峰,雌激素和T3既强烈地降低其抑制效应,也降低其促进效应。同时即使1nmolPrRP也能抵消多巴胺抑制prl释放的效应。而SamsonWK等研究发现,体外培养雄性大鼠垂体细胞试验表明,PrRP及其类似物pfrp-1都不能显著影响PRL的释放。PrRP也不能促进高牛垂体前叶培养细胞中的prl的释放。RubinekT等报道,人PrRP-31能促进人胎儿初级垂体培养物prl的分泌,并呈剂量依赖关系,当达到10nmol的PrRP时,prl的分泌提高到最大值35%。雌激素孵育能增强其促进prl释放的效果。PrRP虽然不能促进prl腺瘤细胞分泌prl,但能促进gh细胞腺瘤分泌prl。PrRP在体内特定的生理环境中起着重要的调节prl分泌的作用。PrRP促进prl的效果主要受性别和发情周期的影响,表明PrRP敏感性受机体内内源性激素水平的影响,特别是雌激素水平的影响。雌性大鼠,尤其是发情前期的雌性大鼠比雄性大鼠对PrRP更敏感。脑室灌流0.1nmolPrRP,可提高大鼠血浆中PRL的水平。IV注射1、10mgPrRP能使雌激素处理的卵巢切除大鼠prl的分泌增加。提前IV注射1mg多巴胺D2受体的抑制剂(sulpiride),能加强PrRP促进prl分泌的作用。ICV0.1～1000ngPrRP在15min内能促进漏斗柄中多巴胺能神经元的活动,血清中prl的水平并没有显著变化。静脉注射PrRP31能提高大鼠血浆中prl的水平,呈剂量依赖性关系。静脉注射50nmol/kgPrRP31后,25min内能显著提高发情前期、发情期及发情后期雌性大鼠血浆中prl的水平(P<0.05);但对于雄性大鼠,只有PrRP31的注射浓度达到500nmol/kg时,才能促进血浆中prl显著提高。PrRP31并不影响其他垂体激素的分泌,表现出了专一促进prl分泌的特性。ICV3nmolPrRP31,能使禁食3d的雌激素和孕激素预处理的去卵巢大鼠prl的分泌波得到恢复。脑室注射抗大鼠PrRP31血清,可使prl分泌波显著下降,同时延迟了prl波的发生。但有些在体试验表明,PrRP对prl的释放没有明显作用。CurlewisJD等研究发现PrRP不能促进雄性大鼠和泌乳大鼠中催乳素的分泌,也不影响及其他垂体激素的释放。ICV1.0和3.0nmolPrRP-31或RFRP-1时,3nmolRFRP-1而不是PrRP-31可以显著提高清醒雄性大鼠prl的释放。静脉注射1mgPRRP不能促进雌激素诱导prl释放的作用。静脉注射3.59μg/kg·BWPrRP不能促进牛prl的分泌,血浆中prl的变化不大,而注射TRH和牛垂体后叶提取物后,血浆中prl立即升高。PrRP对下丘脑-垂体-性腺轴有一定的调节作用,可通过调节下丘脑中的lhrh等来影响腺垂体中促性腺激素的释放。离体试验表明,PrRP并不能直接促进雄性大鼠垂体细胞分泌LH、FSH的释放,但能显著促进下丘脑外植体lhrh的释放(p<0.05)。脑室注射(Intracerebroventricular,ICV)5nmolPrRP,10min后,与注射生理盐水组相比,血浆中LH的水平极显著升高(p<0.001),并持续50min。注射20min后,血浆中的FSH水平极显著升高(p<0.01)。注射60min后,血浆中总的睾酮水平显著升高。PrRP可能通过激活下丘脑中视前区中部GnRH能神经元从而参与调节类固醇类激素诱导的LH的分泌,从而可能参与排卵前期LH的分泌。3nmolPrRP31能使雌激素和孕激素进行预处理的去卵巢大鼠,禁食3d后LH的基础分泌短时间内得以提高。PrRP神经元和下丘脑中CRH能神经元有类似突触的联系,可以通过影响下丘脑而非垂体前叶促进应激激素的分泌。PrRP通过促进下丘脑室旁核中神经肽的释放,如CRH、神经肽Y等来提高血浆中ACTH水平。ICV注射PrRP可以提高血浆中ACTH的水平,同时引起下丘脑室旁核中c-fos的表达。ICV注射5nmolPrRP,10min后血浆中的ACTH含量比注射生理盐水组的显著升高。室旁核直接注射1nmolPrRP,5min后血浆中的ACTH含量显著升高。离体试验中,1～100nmol/LPrRP并不影响垂体前叶细胞ACTH的基础分泌和CRH诱导的释放。100nmol/LPrRP可显著提高下丘脑中CRH的释放,但不影响抗利尿素的释放。同时显著提高神经肽Y的释放;而在奔跑应激(Runningstress)中,PrRP能神经元随着运动强度的增大而活动增强,其产生的内源性PrRP可以减弱ACTH的释放和血浆中乳酸盐的蓄积,并呈剂量依赖性关系;ICV1.0和3.0nmolPrRP-31时,均不能显著提高清醒雄性大鼠血清中ACTH的水平。IVCRH的拮抗剂,并不阻断PrRP-31的作用,但是提前IVCRH的抗血清可显著降低下丘脑-垂体-肾上腺轴对PrRP-31的反应。进一步的研究发现PrRP参与了应激信号的传导,并和NA一起协同提高血浆中ACTH的水平,从而调节下丘脑-垂体-肾上腺轴。下丘脑背内侧核和一些A1/A2神经元可以产生PrRP。A1/A2细胞群中的PrRP神经元含有酪氨酸羟化酶,而此酶是含有儿茶酚胺的神经元的一种标志性酶。A1/A2去甲肾上腺素能神经元在中枢神经系统中能调节应激反应,压力刺激A1/A2去甲肾上腺素能神经元产生NA,NA通过下丘脑CRH促进ACTH的释放。A2PrRP神经元中有雌激素α受体的表达,从而其调节应激的反应受雌激素的影响。雌激素能抑制应激条件下PrRP神经元的激活。水沉浸大鼠可导致A1/A2和下丘脑背内侧核PrRP神经元中c-Fos蛋白蓄积量大量升高。在A1/A2细胞群中的PrRP、酪氨酸羟化酶双阳性细胞中有c-Fos蛋白特异性地表达。ICVPrRP30min后,大鼠下丘脑室旁核中c-fosmRNA的得到最大表达,并呈剂量依赖性关系,同时血浆中皮质酮激素的水平显著升高。ICV抗PrRP抗体能显著降低疼痛刺激引起的室旁核c-fosmRNA的表达。电子显微镜显示室旁核PrRP免疫反应性神经纤维末梢和其它非PrRP免疫反应性神经元有突触联系,一部分神经纤维和末梢位于释放抑制素(SOM)的神经元附近。脑室灌流PrRP可迅速使抑制素能神经元中NGFI-A基因的转录。双层标记原位杂交技术显示SOM能神经元能表达PrRP受体mRNA。因此,室旁核中部分SOM能神经元受PrRP的直接控制。脑室灌流PrRP可引起血浆中GH水平的下降,但当SOM被耗竭或者中和后,其降低作用消失。其机理可能是PrRP旁分泌的形式作用于SOM能神经元,使其释放SOM到垂体门脉中,从而抑制垂体前叶GH的释放。而体外试验的结果与上述结果并不一致,RubinekT等发现PrRP能刺激几种生长激素细胞分泌GH。在雌激素存在的情况下,人PrRP-31能促进发育20～27周的人胎儿初级垂体培养物GH的分泌增加。PrRP也能提高几种腺瘤细胞GH的释放,使其分泌量增加25%～27%,同时促进gh、prl混合肿瘤细胞GH的分泌。而另一方面有研究报道PrRP对成年雄性大鼠垂体细胞培养物GH的释放没有影响。PrRP可能是调节催产素的一种神经调节因子。双层细胞免疫化学试验表明在下丘脑室旁核、视上核中PrRP阳性神经元和催产素阳性神经元有突触联系。ICVPrRP能提高雌性大鼠、雄性大鼠血浆中催产素的水平,同时提高雌性大鼠血浆中抗利尿素的水平。大鼠脑室灌输0.1nmolPrRP可促进REM睡眠,1nmol剂量时可同时促进非REM和REM睡眠,10nmol剂量时只能促进非REM睡