食管酸灌注对内脏高敏感状态大鼠fos蛋白表达的影响

食管酸灌注对内脏高敏感状态大鼠fos蛋白表达的影响

非槟榔反流病（ned）通常很常见，但其病因和发病机制尚不完全清楚。近年来逐步认识到慢性食管内脏高敏感可能是NERD最重要的病理生理特征之一,是NERD患者症状产生的基础和症状多样化的原因。有报道提示中枢神经系统(CNS),尤其是边缘系统参与了食管内脏高敏感的调节,但目前有关CNS参与内脏高敏感的神经核团及环路尚不明确。本课题组在先前的研究中所证实,鸡卵清蛋白(ovalbumin,OVA)可诱发广泛的内脏痛觉过敏及其周边区痛觉超敏,其机制可能与肥大细胞的增生和脱颗粒状态有关。c-fos原癌基因及其编码的相关蛋白作为接受一定刺激的神经元激活的标志,近年来在神经系统形态定位和功能活动相结合的研究中得到了广泛应用。以往的研究证明,食管酸灌注可以诱导正常鼠Fos蛋白在中枢核团内表达,但在内脏高敏感状态下对食管酸灌注诱发的CNS内Fos蛋白表达的影响及其意义了解甚少。因此,我们采用OVA基础致敏大鼠模型,研究在内脏高敏感状态下食管酸灌注后CNS各部位Fos蛋白表达和分布,旨在为内脏高敏感状态下CNS不同核团神经元功能发生不同程度的障碍,整合、处理食管感觉传入信息功能异常提供可视性实验依据。材料和方法一、治疗a组不同剂量的剂量后,c组成年健康Sprague-Dwley(SD)大鼠36只,雌雄不拘,体质量225～285g,由第二军医大学实验动物中心提供。将SD大鼠随机分为5组,A组:正常对照组6只,正常饲养,不予以任何处理,B组:0.9%氯化钠溶液对照组7只,在实验的第0天腹腔注射0.9%氯化钠溶液1.5ml,第14天0.9%氯化钠溶液灌注食管(37℃),C组:食管酸灌注组8只,在实验的第14天行食管酸灌注;D组:OVA致敏组7只,在实验第0天以OVA100mg,辅以氢氧化铝佐剂200mg的混合液1.5ml行腹腔注射致敏,E组:OVA+食管酸灌注组8只,在实验第0天以OVA100mg,辅以氢氧化铝佐剂200mg的混合液1.5ml行腹腔注射基础致敏,第14天进行食管酸灌注。二、方法1.胃压和管口灌流,构成管口实验第14天,对C组和E组动物进行食管酸灌注。动物禁食12～16h,使用2.5%戊巴比妥钠(1ml/kg)腹腔注射麻醉。将麻醉动物平卧位固定,头部抬高20°～30°,切开腹壁和胃壁,将一引流管放置在贲门处以收集从食管滴注的液体。将一单腔灌流管(内径0.50mm,外径0.80mm)经口放置于食管内,导管开口位于食管和胃交界处上2～3cm,固定导管,另一端与持续灌注泵相连。使用0.1mol/L盐酸滴注,滴注液保持37℃,速度10ml/h,共50min。对照组(B组)使用0.9%氯化钠溶液滴注,其余条件同实验组。2.化疗后cci价值检测据报道,Fos蛋白表达产生的高峰时间为食管酸刺激后30min。故B、C、E组大鼠食管酸灌注处理后30min深度麻醉后立即开胸,经左心室至升主动脉插管并加压灌注200ml0.9%氯化钠溶液冲洗全身血液,随后用4℃预冷的含4%多聚甲醛的0.1mol/L磷酸盐缓冲液(PB,pH7.4)500ml加压灌注固定1h。然后取脊髓和全脑组织置于相同固定液,在4℃条件下固定18～20h,再移至含20%蔗糖的0.1mol/LPBS溶液中浸泡过夜至下沉(4℃)。A和D组大鼠于第14天,麻醉后30min相同方法处理。按Paxinos和Watson大鼠脑图谱进行解剖定位,用恒冷箱冰冻切片机—20℃行连续冠状面切片,片厚40μm,隔5取2,切片贴于经APES处理的载玻片上,室温干燥30min,4°℃丙酮固定30min,70℃保存备用。3.小鼠血清中co-1、3.4和3.5%tri能力检测①切片放入含20%甲醇、3%双氧水、0.3%聚乙二醇辛基苯基醚(TritonX100)的0.01mol/L磷酸盐0.9%氯化钠溶液缓冲液(PBS,pH7.4)室温下孵育20～30min;②用含0.01mol/L正常小牛血清(BSA)、0.5%TritonX的PBS液室温下孵育2h;③兔多克隆抗c-fos抗体稀释液(1:2000,Oncogen公司),4℃孵育36～48h;④用SuperPicTure即用型二步法检测试剂盒(由上海蓝创生物公司提供)在37℃孵育10min;上述每一步骤后均用PBS液充分漂洗切片3次,每次3～5min;⑤DAB/H2O2法呈色,即含0.02%H2O2的0.05%DAB溶液显色5～15min(镜控反应时间),入PBS终止反应;⑥最后进行常规脱水、透明、中性树胶封片、光镜观察。切片分两套,一套封片透明,一套用伊红复染。4.染色阳性细胞的检测用日本OlympusBX-50光学显微镜下观察并照相计数各脑区每张切片c-fos阳性神经元的数量。因c-fos表达均呈双侧对称分布,故单侧计数,最后取平均值。在低倍光镜下(40倍)观察染色阳性细胞的分布情况;按Paxinos和Watson大鼠脑图谱,选择不同层面个数,每只动物各选取对应的典型平面(2～5个)以记数FLI神经元的数目。在200倍光学显微镜观察鉴别并依次计数各典型平面c-fos染色免疫阳性细胞的实际数目。然后利用江苏捷达科技公司提供的显微图像分析系统处理并计算出各脑区每张切片、不同特定神经核团内Fos蛋白阳性细胞数量的总和及积分光密度,再求得平均阳性反应的阳性细胞数和免疫阳性反应产物的平均吸光值(A),A值与Fos蛋白表达强度正相关。5.阳性神经元数目采用SPSS11.0软件统计分析,CNS不同神经核团内Fos蛋白阳性神经元数目以表示。采用多组单因素方差分析比较各组间数值,采用配对t检验两组间的差异,P<0.05为差异有统计学意义。结果一、fos阳性神经元的分布Fos样免疫反应阳性产物表现为细胞核内有深褐色或棕黄色颗粒,呈圆形或卵圆形,典型的可见核仁空泡区,胞质和突起均无显色。对各组动物皮质至延髓的全脑切片进行观察。在所观察的5组动物中,在每组动物内Fos阳性细胞既有相似的分布模式,也有一定差异。各组小脑内无明显Fos分布密集区。免疫组化染色替代实验的切片反应呈阴性。1.正常对照组(A组):各脑区Fos蛋白表达水平很低,无明显密集分布区。Fos阳性神经元零星、无规律地分布于孤束核的连接部和内侧部、中央杏仁核、下丘脑室旁核及延髓网状核等,多为浅染。2.0.9%氯化钠溶液对照组(B组):孤束核内侧亚核、背旁核、中央杏仁核出现较多的Fos阳性神经元,着色稍深。在扣带回、三叉旁核、下丘脑的室旁核、下丘脑视上核、最后区、丘脑室旁核等亦有少量散在的、无规律的Fos阳性神经元分布,但无明显密集分布区,多为浅染,其余部位未见明显阳性表达。3.食管酸灌注组(C组):①在大脑皮层、端脑和间脑Fos阳性神经元主要集中分布于扣带回、中央杏仁核、KollikerFuse(KF)核群、下丘脑室旁核、下丘脑视上核、丘脑室旁核。②在脑干和延髓主要分布于中脑导水管周围灰质、臂旁核、疑核、三叉旁核、孤束核中央亚核和最后区,其次分布于腹外侧网状核、迷走神经背核。③前额顶叶皮质和边缘前脑等只见少数标记FLI颗粒细胞核,淡染且散在分布。4.OVA致敏组(D组):在额叶皮质、扣带回皮质、中央杏仁核、下丘脑室旁核、中尾段延髓的孤束核内侧亚核背侧和最后区内有中等密度的分布;在下丘脑视上核、中脑导水管周围灰质、腹外侧网状核、下橄榄核等内也有稀疏的Fos阳性分布,染色较浅。5.OVA联合食管酸灌注组(E组):被激活了一个复杂而广泛的大脑网络,且多数为深染。①在大脑皮层Fos阳性神经元主要分布于第SⅠ、SⅡ体感区、额顶叶皮质、岛叶、扣带回皮质、梨状区皮质(图1),其他皮质及核团分布均稀少;②在端脑和间脑,主要密集于中央杏仁核、KF核群、下丘脑室旁核、丘脑室旁核、下丘脑视上核,在终纹床核、蓝斑和海马内亦可见到中等密度的Fos阳性细胞;③在脑干分布在中脑导水管周围灰质、臂旁核、疑核、三叉旁核内有大量的Fos阳性细胞分布(图2);④在延髓内脏带内由背内侧斜向腹外侧的弧形带状区内有Fos密集分布,在背内侧部主要分布于中、尾段延髓的孤束核联合亚核、内侧亚核、胶状亚核和最后区内(图3);在延髓腹外侧区、迷走神经背核、下橄榄核等也有少量的Fos分布。二、c对大鼠fli神经元表达的影响1.E组大鼠额顶叶皮质、岛叶、扣带回、中央杏仁核、KF核群、疑核、臂旁核、下丘脑室旁核、丘脑室旁核、三叉旁核、孤束核、最后区、延髓网状核等核团FLI神经元的数目较C组和D组显著增加(P<0.05),而迷走神经背核、下丘脑视上核、中脑导水管周围灰质、腹外侧眶皮层等的FLI神经元数量,与C组则差异无统计学意义(P>0.05)。且该组大鼠中央杏仁核、臂旁核、室旁核、三叉旁核、孤束核的FLI阳性产物的A值亦较C组和D组明显增高(P<0.05)。2.C组大鼠在中央杏仁核、KF核群、下丘脑室旁核、下丘脑视上核、丘脑室旁核、臂旁核、疑核、三叉旁核、孤束核中央亚核和最后区等核团的FLI神经元的数目较B组显著增加(P<0.05)。而额顶叶皮质则仅有少数FLI颗粒。3.D组在额叶皮质、扣带回皮质、中央杏仁核、下丘脑室旁核、中脑导水管周围灰质、中尾段延髓的孤束核内侧亚核背侧和最后区的Fos阳性神经元表达,与A组相比有统计学意义(P<0.05)。4.B组在孤束核内侧亚核、背旁核、中央杏仁核的FLI神经元计数明显高于A组(P<0.05)。其余核团计数稍高于A组,但差异无统计学意义。模型制备的可行性1.关于食管内脏高敏感动物模型的制作和方法学:本研究采用腹腔注射OVA致敏联合食管酸灌注制备食管内脏高敏感性大鼠模型。腹腔注射OVA致敏导致整个内脏(包括结肠、食管)的敏感性增加,这可用会聚原理和效应来解释,即当腹腔内脏某部位致敏后,其他区域包括食管出现相应的内脏高敏感状态。其进一步促进和介导食管内脏高敏感的中枢敏化机制的过程,及增强CNS内酸诱导的Fos蛋白表达的机制,有待更深入的研究。c-fos原癌基因及其编码的相关蛋白可作为研究神经传导通路或脑功能活动的一个有意义的标志物,亦可作为中枢神经对疼痛反应的标志物,可用来判断、追踪伤害性刺激信号的传导通路。c-fos还可作为第三信使接受细胞外刺激的短程信息,进而导致细胞功能变化,因而c-fos在神经系统可塑性方面扮演着重要的角色。近年来在神经系统形态定位和功能活动相结合的研究中得到了广泛应用。Fos蛋白形态学显示方法的建立也为研究感觉刺激信息的传导通路提供了一个快捷、敏感和方便的研究手段。虽然结果是通过形态学方法显示,但在某种程度上反映了一定的功能意义,是一种形态学和功能学相结合的指标。因此,本研究中模型制备是可行和成功的。2.CNS内Fos蛋白表达的特点和意义:在正常情况下,c-fos原癌基因在细胞内的表达水平很低,但它能在一系列生理或病理刺激作用下短时间诱导表达,刺激后10～20min即可检出Fos蛋白,60～90min达高峰,可持续2～5h。本实验结果显示,在空白对照组(正常大鼠)CNS均有少量Fos阳性神经元。我们推测,这些正常生活状态下的Fos表达可能与机体的基础代谢以及内脏、躯体功能活动,外界刺激如光线、声音等感觉传入活动有关。因此,我们在实验中轻柔抓取动物,尽量避免外界非特异性刺激(如强光和噪音等),并进行严格的对照实验,保证了结果的特异性。食管0.9%氯化钠溶液灌注可引起CNS内部分脑区FLI神经元表达增多,与既往的研究结果一致。这可能与局部0.9%氯化钠溶液灌注刺激本身即可引起c-fos表达,或与c-fos的敏感度较高,且其表达受到较多的其他因素影响有关。本文发现,单纯OVA致敏组大鼠额叶皮质、扣带回皮质、孤束核、延髓网状核等脑区有中等密度的Fos阳性神经元表达,与空白对照组相比有统计学意义。这提示在内脏高敏感状态下,即使动物在未接受实验性刺激时,其脑区存在着不同程度的Fos蛋白基础表达,即处于亚激活状态,c-fos表达可能与OVA致敏内脏高敏感性改变有密切相关。正常大鼠经食管酸灌注后,c-fos神经元表达较0.9%氯化钠溶液对照组明显增多,与文献报道结果一致,但我们的实验中还观察到一些以往没有报道的在酸灌注激发时被激活的核团,如顶额皮质、岛叶、中脑导水管周围灰质、三叉旁核、腹外侧眶皮层等,这些核团是否与食管内脏感觉有直接关系尚待进一步研究。OVA基础致敏后再进行食管酸灌注则激活了一个复杂而广泛的大脑网络,CNS内从皮质至延髓有广泛的Fos蛋白表达,且在多个部位Fos阳性细胞数目比单独的食管酸灌注组或卵清蛋白致敏组明显增多并集中分布,且所激活的脑区更多,多数为深染。这表明OVA基础致敏对食管酸灌注诱发的CNS内Fos表达有活化作用,增加了多个脑区的FLI神