柳与管花肉蓉的相互作用研究

柳与管花肉蓉的相互作用研究

香蒲肉芽（schanka）是科维那科或科贝隆肉科多年生根生物，寄生于柳根。管花肉苁蓉中主要包括松果菊苷和毛蕊花糖苷等苯乙醇苷类、环烯醚萜及其苷类、木脂素及其苷类等化学成分,具有增强机体免疫力,调节神经内分泌系统的作用、抗氧化作用,延缓衰老作用、增强学习能力等药理作用,是我国名贵中药材之一。寄生植物管花肉苁蓉接种率低是当前主要的生产问题,由于其寄生生长在寄主根上,在田间条件下难以从土壤内观察到生长动态,为了深入研究接种技术和机理,亟需运用新方法实时监测耕层土壤中管花肉苁蓉寄生到柽柳根系的接种过程。近年来,微根管法是一种破坏性小、可定点直接观察植物根系在土壤中生长动态变化的先进技术,拍摄的图片可用WINRHIZO根系分析系统进行分析,该系统已广泛用于研究水分与根系空间分布和形态变化的关系、肥料与根系分布和产量的关系、细根季节变化动力学等多个方面,但未见采用WINRHIZO扫描微根管法研究管花肉苁蓉接种的报道。本试验采用微根管法辅助根系分析系统WINRHIZO软件,原位观测了耕层柽柳根系形成及管花肉苁蓉接种过程,并测定了接种后管花肉苁蓉生长和苯乙醇苷等化学成分的变化动态,为进一步研究管花肉苁蓉接种条件和提高接种率的技术提供理论依据。1材料和方法1.1土壤耕层养分情况本试验于2011年在北京市中国农业大学上庄实验站进行,实验站位于40.138°N,116.174°E,土壤耕层养分情况是速效氮80.86mg/kg,速效磷8.65mg/kg,速效钾102.45mg/kg,有机质8.20g/kg。1.2树脂玻璃根系显微观测管花肉苁蓉(Cistanchetubulosa)种子。柽柳(TamarixchinensisLour.)插条:长度(15±1)cm,粗度(1.2±0.2)cm,插条鲜重(20±5)g。树脂玻璃根系微型观测管,长2.0m,外径6.0cm,根管的末端封死,露口端用特制的树脂玻璃帽盖住。仪器:KH-100B数控超声波清洗器(昆山禾创超声仪器有限公司),UV8000S型紫外可见分光光度计(上海元析仪器有限公司),Agilent1100LC高效液相色谱仪(美国Agilent公司)。1.3方法1.3.1柳插苗接种动态监测将微根管水平放置在长2m,深30cm,宽10cm的沟内,于紧贴微根管外壁均匀铺撒1.000g管花肉苁蓉种子,用红砖挡在根管露口侧做标记,最后向沟内填土、整平、压实,在沟上方按间距10cm扦插柽柳,柽柳插条露出地面5cm,插后浇透水。育苗过程中,按需适时浇水,保持适当的土壤水分。分别在柽柳扦插后第15、30、45、60和75天,利用微根管(Minirhizotron)技术监测柽柳根系生长生态及管花肉苁蓉接种动态。取景时在根管内插入连接电脑的摄像头,摄像头的取景范围为20cm,360°全景图像扫描。图像保存为BMP格式,宽度为1700像素,高度为1540像素,水平分辨率和垂直分辨率均为199DPI,用WINRHIZO软件处理,计算出根长、表面积、体积、投影面积、直径、根尖数等。1.3.2管花肉丽柳株数的测定于移栽时和移栽后每隔1个月取样,选取长势一致的柽柳20株,将管花肉苁蓉从柽柳上分离,记录寄生上管花肉苁蓉的柽柳株数;将每株柽柳上的管花肉苁蓉合并,并用清水冲洗干净后置于60℃烘箱中烘至恒重,称量单株柽柳上所有管花肉苁蓉的总干重。1.3.3高效液相色谱法按照2010版《中国药典》的方法测定松果菊苷和毛蕊花糖苷的含量,将干燥后的管花肉苁蓉粉碎至60目,称1.000g样品用50%甲醇超声提取40min,取10μL上清液过Agilent1100LC高效液相色谱仪,色谱柱为PhenomenexLunaC18(2)100A(4.6mm×250mm,5μm)柱,以甲醇为流动相A,0.1%甲酸为流动相B,梯度洗脱0～27min(A26.5%+B73.5%),27～50min(A26.5%→29.5%+B73.5%→70.5%),50～57min(A29.5%+B70.5%),检测波长330nm,柱温30℃。按照文献资料的方法测定可溶性糖含量,将管花肉苁蓉干燥粉末加蒸馏水煮沸,重复提取2次,合并上清液,加蒽酮和浓硫酸显色,在630nm处检测吸光度。1.3.4数据处理与统计分析试验数据用MicrosoftExcel2007和SPSS18.0软件进行处理和统计分析。根系形态结构数据用根系形态学和结构分析应用软件WINRHIZO识别和测定。2结果与分析2.1扦插期根长和根直径从图1可见柽柳扦插苗地下根生长动态变化情况,生长速度出现“慢-快-慢”的基本规律。扦插后15d未见生根;扦插后15～30d是根系的慢速生长期,到第30d时柽柳苗的根长为14.20cm,根平均直径为0.3829mm,总表面积1.7388cm2,总体积为0.0197cm3,根尖数10个;扦插后45～60d是生根速度最快的时期,这个阶段根长由36.61增加到137.56cm,伸长速度为6.7cm/d,根直径从0.2608长至0.3939mm,根尖数从21增加到82个,增加速度为4个/d,根总表面积和总体积也分别增加了3.7和4.1倍;扦插后60～75d柽柳根系又进入缓慢生长期,根长的生长速度降为2.4cm/d,根直径维持在0.39mm,根尖数增加速度为1.5个/d。2.2管花肉莎成功从第65d柳管撒入根的培养根据微根管法原位扫描所得到的图片,扦插柽柳后15、30、45和60d均未见有管花肉苁蓉寄生,扦插后第75d首次出现管花肉苁蓉成功寄生的现象(图2)。图2(a～e)所示为撒种后75d柽柳根的原位扫描图,图2(f)为放大后清晰可见的小管花肉苁蓉及柽柳的接种根。应用微根管法可以直观的得出这些管花肉苁蓉是柽柳扦插后60到75d内寄生到柽柳根上的,即管花肉苁蓉的接种时间是柽柳扦插60d以后。2.3管花肉创造干物质量的变化柽柳的被寄生率和单株柽柳上管花肉苁蓉的干物质量是影响管花肉苁蓉产量的两个最关键因子,接种上管花肉苁蓉的柽柳植株数越多,每株柽柳上管花肉苁蓉的干物质量越多,则管花肉苁蓉产量越高。本研究定期调查了柽柳的被寄生率和单株柽柳上管花肉苁蓉的干物质量,从图3(a)可看出管花肉苁蓉移栽时柽柳的被寄生率仅16%,栽培1个月后迅速增长到52%,栽培的第2个月继续保持增长趋势,从52%增加到73%,栽培后第3个月起柽柳的被寄生率趋于稳定,保持在85%左右。说明从移栽第3个月起,柽柳的被寄生率不再是限制管花肉苁蓉产量的主要因素。由图3(b)可见管花肉苁蓉的干物质量在移栽后的第1～3个月处于缓慢增长时期,单株管花肉苁蓉干物质量从开始移栽时的0.075g,增加至第3个月末期的2.222g。移栽后第4、5个月是管花肉苁蓉干物质量迅速增长的时期,其中第4个月内干物质量从2.222增加到8.125g,平均每天增加0.197g;第5个月内干物质量从8.125增加到17.469g,平均每天增加0.311g。2.4管花肉纤维蛋白与糖苷含量的变化管花肉苁蓉中主要药效成分是苯乙醇苷类物质,其中《中国药典》规定的检测成分包括松果菊苷和毛蕊花糖苷。本研究利用高效液相色谱法测定了管花肉苁蓉中的松果菊苷和毛蕊花糖苷含量,从表1可见随着栽培时间的延长,管花肉苁蓉中苯乙醇苷总量呈逐渐降低的趋势,开始移栽时总含量高达26.0%,其中松果菊苷含量为20.9%,毛蕊花糖苷含量为5.1%;栽培4个月后苯乙醇苷总含量降低到11.6%,其中松果菊苷含量减少了11.1%,降至9.8%,毛蕊花糖苷含量减少了3.3%,降至1.8%;从栽培后第4个月起管花肉苁蓉中的松果菊苷、毛蕊花糖苷和苯乙醇苷的总含量均处于稳定状态,分别保持在9.6%、1.7%和11.3%附近。2.5管花肉茉可溶性糖含量的变化管花肉苁蓉中的D-甘露醇和多糖类成分是抗衰老作用的主要活性成分,本研究利用蒽酮比色法测定了管花肉苁蓉中可溶性糖的含量,从表2可看出随着栽培时间的延长,管花肉苁蓉中可溶性糖含量呈逐渐降低的趋势,开始移栽时含量高达267.53mg/g,移栽后第1个月内减少了13.00mg/g,降低到254.53mg/g;第2个月内减少了5.55mg/g,降低到248.98mg/g;第3个月和第4个月分别又减少了18.85和34.36mg/g,降低到195.76mg/g;第5个月内降低幅度减少,可溶性糖含量稳定在195mg/g附近。3结论和讨论3.1管花肉创造的采挖动态管花肉苁蓉寄生于柽柳的根部,人工栽培管花肉苁蓉是在柽柳根附近开沟撒管花肉苁蓉种子然后覆土,在接种管花肉苁蓉后,不能从寄主或土壤的外部形态变化分辨出是否接种成功,更不能定位管花肉苁蓉的寄生位置,即不能确定管花肉苁蓉的接种时间和接种位置,导致采挖药材时,必须根据寄主根生长方向大面积开沟寻找管花肉苁蓉,这种盲目的采挖方法不仅耗费劳力,而且时常损伤管花肉苁蓉的肉质茎,使药材质量降低。本研究中首次采用微根管法定点原位野外观察柽柳根和管花肉苁蓉的接种动态,该方法既能在保持土壤环境原状的情况下监测寄主柽柳的根系形态变化,又可快速准确的定位管花肉苁蓉的接种位置,可以实现对寄主根形态的观察以及寄生关系建立的随时监测。同时利用微根管法动态监测管花肉苁蓉的接种过程,有助于研究寄主根生长环境中的土壤温度、湿度、肥力等因子对根寄生植物种子萌发和接种的影响,进而可通过改善土壤营养和水分等因素,调控寄主根系形态,从而为生产上促进寄生植物接种率提供参考。3.2管花肉丽在柳体内的生长育苗期内柽柳扦插苗根的生长速率表现出“慢-快-慢”的基本规律,15d开始萌芽,15～30d缓慢生长,45～60d为生长速度最快的时期,60～75d又进入慢速生长期。动态监测图像表明柽柳扦插后60d内未见管花肉苁蓉寄生,60～75d管花肉苁蓉成功寄生到柽柳根部。因此,柽柳苗在60d以后生长速度减慢的可能原因是管花肉苁蓉寄生后为了维持生长必须从寄主体内吸取养分,使得柽柳体内的储存物迅速向管花肉苁蓉内转移。本结果与前人对其他寄生植物的研究发现相类似,即寄生植物可显著影响寄主的生长,削弱寄主的生长速率,降低寄主的生物量,严重时甚至可致寄主死亡。如根性半寄生植物独脚金(Strigahermonthica)侵染寄主高粱后,可使高粱的生物量减少30%以上;在西班牙南部、摩洛哥、埃及和以色列等地栽培的大豆常被列当科寄生性杂草侵染,这些杂草可使大豆减产80%以上;油杉寄生属(Arceuthobiumspp.)的寄生植物可以诱导寄主在生理和形态上发生变化,显著增加寄主的水分消耗并降低寄主的叶片水势,导致寄主植株的生长量减少80%左右。3.3培养阶段的作品管花肉苁蓉的干物质积累分成两个阶段,第1个阶段是移栽后的前3个月,此时期内单株柽柳上管花肉苁蓉的干物质积累量缓慢增长,但柽柳的被寄生率处于迅速增长;第2个阶段是移栽后的第4和第5个月,此时期内单株柽柳上管花肉苁蓉的干物质积累量迅速增长,但柽柳的被寄生率处于不再增长。由此说明,前3个月内限制管花肉苁蓉产量的主要因子是接种率,后期限制管花肉苁蓉产量的主要因子是单株产量。因此,通过合理的栽培措施,在前3个月内注重柽柳的根生长,以提高柽柳的被寄生率,后期注重管花肉苁蓉的营养供应,以迅速增加管花肉苁蓉的干物质量,才能最大限度地提高管花肉苁蓉地产量。3.4管花肉创造不同生长阶段培育干物质量的影响管花肉苁蓉内的松果菊苷、毛蕊花