中草药膜荚黄芪根部多糖免疫受体研究

文献翻译

妍妍中草药膜荚黄芪根部多糖免疫受体研究

摘要：草药膜荚黄芪根部的免疫增强作用与它的多糖部分，即黄芪多糖（APS）密切相关,我们再此通过检测细胞增殖和细胞因子产量证明APS能激活鼠的B细胞和巨噬细胞，而不能激活T细胞。通过流式细胞检测分析及共聚焦激光扫描显微镜检测发现，荧光标记的APS（FL-APS）能够选择性侵染鼠的B细胞、巨噬细胞及人的肿瘤细胞系THP-1(单核白血病细胞)。这种与B细胞、巨噬细胞特异性的结合可被细菌脂多糖（LPS）竞争性地抑制。兔抗鼠免疫球蛋白抗体（Ig）能够抑制APS诱导的B细胞增殖和APS与B细胞结合。此外，APS能够有效刺激C3H/HeJ小鼠（其TLR4分子突变而无信号传导能力）脾脏B细胞增殖，上述结果表明，APS通过细胞表面不依赖TLR4而是通过免疫球蛋白来激活B细胞。有趣的是，APS对C3H/HeJ小鼠巨噬细胞的刺激无反应，说明APS介导的激活巨噬细胞作用与TLR4密切相关。抗鼠TLR4单克隆抗体能够部分抑制APS与巨噬细胞的结合，提示APS与细胞表面的TLR4具有直接的相互作用。这些结果从分子水平揭示APS免疫作用机理。材料和方法动物和抗体1、动物和抗体试验动物：雌性BALB/c小鼠，购自北京大学健康科学实验动物中心；雌性C3H/HeJ小鼠，购自中国科学院上海实验动物中心。所有的动物均饲养于免疫教研室。抗体：抗鼠TLR4或RP105单克隆抗体，购自Invivogen公司；鼠抗人CD14单克隆抗体购自R＆D公司；兔抗鼠多抗和未免疫的兔或鼠IgG由本实验室制备。2、黄芪多糖的制备黄芪根切片，用沸水萃取三次。上清液加到用0-2mol/L氯化钠线性梯度洗脱的DEAE-Sephacel中。碳水化合物组分浓度的测定采用苯酚-硫酸法。碳水化合物各组分混合，并且沉淀用酒精洗三次。产生的多糖提取物是针对水的几个变化透析的，然后冷冻干燥。最终产品的碳水化合物的含量为97％，提取的蛋白质和核酸污染可以忽略不计（在280和260nm处的吸光度值接近于零）。用凝胶过滤法测定提取物的分子量大约3500~1.58*10^6。应用薄层色谱法和气相色谱分析糖成分表明，鼠李糖，木糖，葡萄糖，半乳糖，人，和FRU与鼠李糖：木糖：葡萄糖：半乳糖：人的摩尔比为：FRU¼4.9:4.7:8.3:122.2:2.2:3.1。3、细胞培养液所有的细胞在R10的RPMI-1640培养液中培养（Hyclone公司），并添加10％（V/V）FCS（Hyclone公司）、青霉素/链霉素（100U/ml）、L-谷氨酰胺（2mM）、和2-ME(5*10^5M)。肿瘤细胞系的Raji细胞，THP-1，CCRF-CEM，来自于美国的ATCC，并在其实验室保存。4、荧光标记的APS和葡聚糖的制备基本上与Glabe所描述的情况一致。简言之，APS或葡聚糖（分子量70,000，Sigma公司）的溶液（20mg/ml）与0.2毫克溴化氢（50mg/ml）和0.2M氢氧化钠混合，在PH11时磁力搅拌15分钟。在pH8.0时对钠硼酸盐缓冲液透析后20小时，经溴化氰活化的APS或葡聚糖与2mg荧光素胺（Sigma公司）体积小于4毫升混合10小时。合成的荧光标记的多糖经葡聚糖凝胶G-50（Pharmacia公司）的凝胶过滤柱（2*40厘米）与无荧光素胺分离。收集洗脱组分（3毫升/管）并且在440nm处波长处测荧光素胺的浓度。用含荧光素胺的梯度稀释液(从2到200µM)制备标准曲线。用稀释后的葡聚糖构建标准曲线。5、小鼠脾脏T细胞，B细胞，贴壁细胞和腹膜巨噬细胞的准备BALB/c或C3H/HeJ小鼠的脾脏，轻轻按在不锈钢筛（200目）上用注射器柱塞捣碎。红细胞用蒸馏水短时间处理裂解，脾细胞洗涤两次，使之在完全R10中悬浮。

新鲜配制的、应用R10重悬为10^7个/ml的BALB/c小鼠脾细胞接种到90毫米组织培养皿中，37℃、二氧化碳培养箱中培养4小时。收集没贴壁细胞用PBS洗两次，然后将涂有磁珠的CD19（B细胞表面抗原）大鼠抗小鼠的单克隆抗体，（MyltenyiBIOTEC）在密度为10μg抗体/10^7脾细胞中4℃培养30分钟。标记的细胞用PBS洗两次，然后用于磁珠分离柱，流出的非B细胞被收集。经过进一步清洗，移去磁选机，B细胞用柱塞冲洗。为了增加非B细胞内T细胞的纯度，重新用分离柱分离并收集T细胞（流出物）。B细胞与带有FITC标记的抗鼠免疫球蛋白抗体（IgG）、T细胞与带有的FITC标记的抗鼠CD3抗体4℃反应30分钟。用流式细胞仪分析两部分的B细胞和T细胞的纯度大于95％。用移液管反复吹打收集贴壁细胞（主要是巨噬细胞），PBS洗两次。为了获得小鼠腹腔巨噬细胞，在断颈椎处死前3天，将BALB/c和C3H/HeJ小鼠分别用3％硫乙醇酸盐处理。使用冰的冷Ca2+和无Mg2+PBS进行腹腔灌洗获得巨噬细胞。悬于冷PBS，离心收集细胞。6、增殖实验新鲜制备的脾细胞（4*10^5），T细胞或B细胞(2*10^5)培养在96孔板（NUNC），每孔200µl，其中存在或不存在不同浓度的黄芪多糖，脂多糖，fl-aps或葡聚糖。37℃，5％CO2培养3天。在最后的8小时孵化中，每孔添加[3H]胸腺嘧啶（[3H]TDR，0.2µCi/孔）。然后用96孔板（Tomtec）收获细胞，放到纤维过滤器，在放射性的无光过滤器上用MicroBeta，TRILUXLSC计数器计数。7、RT-PCR检测T细胞IL-2mRNA的表达BALB/c小鼠脾细胞上在有或无葡聚糖或者APS（100μg/ml）或ConA（5μg/ml）的24孔板上，培养24小时。获得的细胞用Trizol试剂（Invitrogen公司）提取细胞总RNA，然后用oligo（dT）16引物反转录成cDNA。进行PCR，样本加热至94℃5分钟，94℃30秒，51℃1分钟，72℃2分钟，72℃10分钟，循环40次。PCR产物在1％琼脂糖凝胶电泳（溴化乙锭染色）。采用的IL-2引物序列如下：上游引物：5ˊ-CTTGCCCAAGCAGGCCACAG-3ˊ;下游引物：5ˊ-GAGCCTTATGTGTTGTAAGC-3ˊ；β-actin,上游引物：5ˊ-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3ˊ;下游引物：5ˊ-CTTCCTTAATGTCACGCACGATTTC-3ˊ。IL-2和β-actin的引物PCR扩增产物，分别为在307和540bp8、腹腔巨噬细胞细胞因子的产生葡聚糖、APS（100μg/ml）或LPS（5μg/ml）培养小鼠腹腔巨噬细胞40小时。用ELISA试剂盒分别检测上清液中的IL-1β和TNF-a的浓度。9、荧光染色、流式细胞仪分析及共聚焦激光扫描显微镜检查将上述细胞悬液离心，培养细胞（1*10^6/管）然后再悬浮,，与50µlFL-葡聚糖或FL-APS（150μg/ml）混合4℃1小时，细胞用PBS洗三次并且悬浮在1ml染色缓冲液（0.1％NaN3和0.2％BSA的PBS）用流式细胞仪（流式细胞-Dickinson公司）分析。染色后的THP-1细胞散布在载玻片上，固定后使用LeicaTCSSP2的共聚焦激光扫描显微镜观察。在一些实验中，小鼠的贴壁脾细胞，纯化的B淋巴细胞，THP-1细胞，巨噬细胞在染色前使用5μg/ml的胰蛋白酶在37℃处理20分钟。昆布多糖，一个低分子量中性β-葡聚糖的聚合物，购自Sigma公司。低聚甘露糖由付博士（中国科学院信息工程研究所）提供。抑制实验，细胞（1*10^6/管）分别用1mg/ml葡聚糖、昆布多糖、低聚甘露糖、LPS（Sigma,）或400lg/mlAbs处理1小时，洗后用FL-APS（0.3mg/ml）在4℃处理1小时，细胞悬浮于1mlPBS中用流式细胞仪分析。10、内毒素污染的测定APS和LPS样品（30μg/ml的APS和0.01μg/ml脂多糖）中的内毒素浓度测量用LAL显色试剂盒（益华生物）。11、统计学分析每个实验至少重复三次。结果是以平均值±标准误来表示。数据用t检验进行比较。P值<0.05％为差异显著。结果1、APS和葡聚糖的荧光标记（图1）

溴化氰活化的APS（A）和葡聚糖(B)与荧光素胺在室温下反应10小时。混合物经Sephadex-G50柱分级分离，荧光素胺与多糖的结合物与未结合的荧光素胺分离开，对各组分荧光素胺（●）和糖类（○）的浓度（μg/ml）进行了测定。结合物数量很少，且较未结合的荧光素胺洗脱的快。2、在体外用APS激活B淋巴细胞和巨噬细胞

图（2A），用APS、FL-APS或葡聚糖在指定浓度下刺激BALB/C小鼠脾细胞。APS、FL-APS同样有效并且脾细胞在体外增殖显著。表明APS与荧光素胺的结合对其免疫生物学活性没有明显改变。图（2B和2C），APS在体外主要刺激B细胞不能直接激活T细胞。图（2D），APS，葡聚糖，ConA或单独培养基（MED）刺激后，脾细胞中IL-2和β–actionmRNA的表达通过RT-PCR来检测。APS不能诱导脾细胞中IL-2mRNA的表达。{[3H]胸腺嘧啶掺入法（CPM）}当用APS或葡聚糖刺激BALB/c小鼠的巨噬细胞40小时，发现APS组培养上清中IL-1β和TNF-α显著增多，这表明APS也能激活巨噬细胞。表1APS刺激腹腔巨噬细胞细胞因子产生（IL-1β和TNF-α浓度采用ELISA法测定）3、小鼠巨噬细胞、B细胞和人类THP-1细胞株选择性结合APS（流式细胞仪分析）图（3A-E）用Fl-APS或fl-dextran染色新鲜BALB/c小鼠巨噬细胞、T细胞和B细胞通过Fl-APS染色与其功能研究结果相一致的是小鼠的脾细胞、腹腔巨噬细胞、脾贴壁细胞（主要是巨噬细胞）和B细胞，而不是T细胞。图（3F-H）经胰蛋白酶预处理后