实验13 cDNA的合成及RT-PCR法研究基因的表达

实验13cDNA的合成及RT-PCR法研究基因的表达

原理：逆转录PCR，或者称反转录PCR(reversetranscription-PCR,RT-PCR)，是聚合酶链式反应(PCR)的一种广泛应用的变形。基因表达检测有几种方法，主要包括原位杂交、Northern实验、RNA酶保护实验，Real-tinePCR以及半定量RT-PCR等。其中半定量RT-PCR由于操作简单，检测mRNA水平的表达灵敏，被作为检测基因表达的主要手段之一。RT-PCR是指将逆转录(ReverseTranscription；RT)反应和PCR(PolymeraseChainReaction)反应组合在一起的方法，其主要是以管家基因（beta-actin或GAPDH）作为内参，对某一基因在mRNA的水平上进行检测或定量。RT-PCR将以RNA为模板的cDNA合成同PCR结合在一起，提供了一种分析基因表达的快速灵敏的方法。RT-PCR还可用来检测基因表达差异或不必构建cDNA文库克隆cDNA。RT-PCR比其他包括Northern印迹、RNase保护分析、原位杂交及S1核酸酶分析在内的RNA分析技术，更灵敏，更易于操作。RT-PCR广泛应用于遗传病的诊断，并且可以用于定量监测某种RNA的含量。(检测基因表达的方法)RT-PCR的模板可为总RNA或poly(A)+选择性RNA。逆转录反应可使用逆转录酶，以随机引物、oligo(dT)或基因特异性的引物（GSP）起始。RT-PCR可以一步法或两步法的形式进行。在两步法RT-PCR中，每一步都在最佳条件下进行。cDNA的合成首先在逆转录缓冲液中进行，然后取出1/10的反应产物进行PCR。在一步法RT-PCR中，逆转录和PCR在同时为逆转录和PCR优化的条件下，在一只管中顺次进行。两步法程序:Inthefirsttube,first-strandcDNAsynthesisisperformedunderoptimalconditions,usingeitherrandomhexamers,oligo(dT)

primers(generatingacDNApool),orsequence-specificprimers.AnaliquotoftheRTreactionisthentransferredtoanothertube(containingthermostableDNApolymerase,DNApolymerasebuffer,andPCRprimers)forPCR.优点:ThismethodisusefulforexperimentswheremultipletranscriptshavetobeanalyzedfromthesameRTreactionorforspecificapplicationssuchasDifferentialDisplayReverseTranscription(DDRT)orRapidAmplificationofcDNAEnds(RACE).Also,sincetheRTreactionisperformedunderoptimalconditions,thisapproachproducesthelongestRT-PCRproducts(upto14kbinlength,iftheappropriateenzymesareused).RT-PCR常见问题分析及其解决方案二、实验目的1、学习基因特异性引物的设计。2、学习和掌握RT-PCR的原理和方法。3、学习和掌握用半定量RT-PCR对基因表达水平进行相对定量的原理和方法。三、实验程序

1.提取RNA，通过OD值测定对RNA样品进行定量。2.RNA的纯化及RNA中DNA的去除3.根据基因序列设计扩增目的基因以及看家基因的引物。

4.RT-PCR扩增目的基因及看家基因。

5.产物进行琼脂糖凝胶电泳，分析结果。

一.拟南芥总RNA的提取

二.RQ1RNase-FreeDNase消化总RNA去除DNA污染1.建立如下反应体系:RNAinwaterorTEbuffer40ul10×reactionbuffer10ulRQ1RNase-FreeDNase(1U/ug/RNA)40ulDEPC处理水10ul2.37℃30min3.加等体积水饱和酚:氯仿,12400rpm,15min4.取上清到一新eppendorftube中,加2.5倍体积的无水乙醇,12400rpm,15min.5.70%乙醇洗涤一次,加50ulDEPC处理水溶解,-20℃保存.

三.快速mRNA纯化

一.快速mRNA纯化试剂盒说明(深圳依诺金生物科技有限公司)60min可充分回收mRNA,回收率达到90%;

对各种剂量的起始总RNA均能灵活适应(50-50