慢病毒生产及使用操作手册

--39-慢病毒生产及使用操作手册一、试验流程制备慢病毒穿梭质粒及其关心包装原件载体质粒293T6h4872h以下内容由汉恒生物科技〔上海〕总结。二、试验材料〔一〕慢病毒载体、包装细胞和菌株该病毒包装系统为三质粒系统，组成为pspax2,pMD2G,pHBLVTM系列质粒。1、载体信息〔见附录〕2、细胞株293T，慢病毒的包装细胞，为贴壁依靠型成上皮样细胞，生长培育基为DMEM10%FBS)。贴壁细胞经培育生长增殖形成单层细胞。3、菌株大肠杆菌菌株DH5α。用于扩增慢病毒载体和关心包装载体质粒。293T〔一〕293T随着传代的次数增加，293T细胞会消灭生长状态下降、突变等。为了防止此类现象的生长期进展冻存，增加细胞复苏成活率。1、去掉上清液，参与PBS20.25%的胰酶，消化12min～胰酶，参与颖培育基吹打混匀，移入离心管中。33mL37℃预热的10％DMEM，用10mL移液管进展吹打，较大力吹打6～8次即可，不留死角，之后，将全部细胞吸出，置于15mL离心50ul混匀后的细胞于1.5mLeppendorf450ul10％DMEM，即为1010ul4大格，每大格16小格。计4大格均计数，总数除以〔得每大格细胞数，再乘以1〔10倍稀释，即为实际n/mL细胞浓度。4、细胞离心，1000rpm，5min。去掉上清。5、依据细胞计数结果参与细胞冻存液〔70%完全培育基+20%FBS+10%DMSO〕,重悬细胞，3x106个/ml。6、分装进细胞冻存管，放入冻存盒中，放入-80℃超低温冰箱。7、其次天将细胞放于液氮罐中长期保存，并作记录。保存过程中，要不时复苏细胞检测细胞存活率，观看细胞状态等。〔二〕293T当细胞生长到集合率到达80%～90%时需要对细胞进展传代操作，以扩大细胞数量，维持细胞良好的生长状态。1、消化细胞，方法同细胞冻存。2、细胞离心完毕后，参与完全培育基重悬。310cm10ml437℃、5%CO295%相对湿度的培育箱中培育。〔三〕293T冻存的细胞进展复苏。137～42℃的水浴。2、查看细胞库记录，依据记录从液氮罐中取出冻存的细胞〔需戴上棉手套，防止被冻伤，快速丢入水浴锅中并快速晃动，尽量在～2min内使细胞溶液完全溶解。315ml1ml心，1000rpm，5min。45ml6cm537℃、5%CO295%相对湿度的培育箱中培育。6、其次天观看细胞存活率。给细胞换一下培育基。以后每天观看细胞生长状况。四、慢病毒包装和浓缩〔一〕质粒扩增构建好的慢病毒载体和关心质粒需经过大量抽提，浓度大于1ug/ul,A260/280在1.7-1.8Qiagen〔二〕293T293TT752mL40.25%胰酶，使其均匀掩盖瓶底，置于37度培育箱中3-5min，取出，摇摆可觉察细胞于底部脱离，将其全部3mL3710％DMEM10mL打6-815mL50ul1.5mLeppendorf450ul10％DMEM1010ul41644〔得每大格细胞数〕，10〔10〕，n/mL900-1000/T75350-400/T75。T7510mL10％DMEM80-90％满即可进展转染。转染前无需换培育基。〔三〕做脂转complexDMEM需在37LipoFiteTM匀。转染每瓶T75complexpspaxpspax10μgPMD2G10μgpHBLVTM系列载体10μg6h注：LipoFiterTM转染试剂为汉恒生物产品，使用说明参考LipoFiterTM说明书。〔四〕病毒收集转染后48和72h(24h0.45μm40mL4℃，72023g/min120〔五〕病毒重悬和保存500ul颖培育液重悬病毒沉淀，置于-80五、感染目的细胞〔一〕细胞预备241×105/ml50%70%直接。〔二〕病毒感染1.polybrenePolybrene率，通常参与polybrene2～10Polybrenepolybrene时是否适合polybrenepolybrene1～10μg/ml24h内细胞无明显毒性反响为佳polybrene6～8μg/ml。注：1〕汉恒生物的自产的Polybrene产品，用户可用以进展关心感染。供给的Polybrene20℃〔1〕，3响。4℃2Polybrene预试验请先以比照病毒进展摸索MOI及Polybrene2。感染细胞最正确MOIMOI〔MultiplicityofInfection，感染复数〕是指每个细胞感染的病毒数，通常MOI越高，病毒整合到染色体的数量以及目的蛋白的表达量越高。Hela293MOI=1～380%以上的细胞均表达目的基因。MOIMOI感染步骤按试验需要将细胞铺板〔比方12〕。细胞数以第250%为宜。37℃培育过夜。PolybrenePolybrenePolybrene终浓度为摸索得到的最适终浓度。移去培育基并添加0.5mlPolybrene/培育基混合物于每孔中〔适用于24孔板，其他孔板请相应调整体积。〕对于不适用Polybrene的细胞，以上步骤省略，直接进入下面步骤。病毒小培育体积感染表培育皿类型外表积/cm2对应细胞培育液体积病毒感染对应细胞培育液体积96-well0.3cm2100ul50ul24-well2cm2500ul病毒小培育体积感染表培育皿类型外表积/cm2对应细胞培育液体积病毒感染对应细胞培育液体积96-well0.3cm2100ul50ul24-well2cm2500ul250ul12-well4cm21ml500ul6-well10cm22ml1ml60mm20cm24ml2ml100mm60cm210ml5ml4小时后补足至培育体积，感染242小时后直接换液〔2437℃培育。48小时，对于带GFPGFP对于携带PuromycinPuromycin选稳定转导的细胞株〔详见下方〕。留意：溶化的shRNA可使病毒效价降低。PuromycinPuromycin1～10μg/ml，不同细胞puromycin同，请查找相关文献〔局部细胞参考用量见以以下图〕，另外请设不感染筛选比照〔未经过病毒感染的野生型细胞〕，参与等量等浓度的puromycin。CelllineSpeciesCelllineSpeciesPuromycin(µg/ml)293Human3HeLaHuman3B16Mouse1-3PC1.0Hamster10MC3T3-E1Mouse10H9C2Rat1MCF-7Human1-3MDA-MB-×××Human1-3HepG2HepG2Human2HT1080Human1A549Human1.5H1299Human2Humanembroyonicstemcells〔HumanESCs〕Human1Puromycin每2-3天换含puromycin的完全培育液一次，至不感染筛选比照组细胞被puromycin杀光，可进展以下两步操作〔依照具体试验需要选择〕。不挑取单克隆：puromycin3挑取单克隆：5puromycin维持性筛选培育。扩增完毕后westernblotQPCR3感染悬浮细胞转染法，马上适量的病毒液参与细胞培育皿后，封好口，放入平角离心机后，低速〔500g-1000g/min〕离心1h，然后放入培育箱中正常培育即可。假设由于试验条件有限，没清，然后参与适量的病毒液，室温放置15min〔不能超过半小时〕，然后将细胞和病毒液同时吸出转入培育皿中连续病毒感染过夜后换液即可。对于极难感染的细胞对于极难感染的细胞，如DC〔树突状细胞〕等，可承受屡次感染的方法，即感染24小时后，更换颖病毒进展二次感染，可显著提升感染效率。1：汉恒生物慢病毒质粒图谱过表达单标记双标记IRES载体慢病毒过表达载体，ZSGreen/puro标记-44-T2A系列载体：ZsGreen-T2A-Puro RFP-T2A-PuroLuc-T2A-Puro ZsGreen-T2A-LucRFP-T2A-luc干扰单标记-45-双标记IRES系列载体慢病毒shRNA干扰载体，ZSGreen/puro标记-46-T2A系列载体：ZsGreen-T2A-Puro RFP-T2A-PuroLuc-T2A-Puro ZsGreen-T2A-LucRFP-T2A-luc-47-特别用途用于融合蛋白构建 慢病毒载体启动子替换Tet-onsystem慢病毒载体：单病毒系统，无须另外表达rtTA，出毒率低，只做建系用，无法供给病毒Tet-on过表达系统，目的基因MCS区，只在DOX存在下才表达，puro可持续表达，用于筛选pUCsv40orisinLTR

AMP

Zeo”1

TRE Tet-on干扰系统，应用mir30sh-mirtuboRFPDOXwPRE pTRIPZ13320bpPuroR

CMV-minimal(-50to+8)regAgeI(2991)

RFPsh-mir构造启动表达，因此会看到加Dox24小时有荧光消灭；puro为持续表达，用于筛选IRES

shRNAmir

turboRFPClaI(3702)HpaI(3791)xhoI(3805)EcoRI(3829)

留意：sh-mir合成格外贵UBCprom

MluI(4063)-48---60-2：慢病毒滴度测定方法简介:1、细胞预备将生长状态良好的293T1x105/ml,96100ul/孔，637℃，5%CO2培育箱中培育。2、加病毒其次天，在EP管中做3661.5mlEP90ul10ul吸取10ul参与其次个管混匀。以此类推，做十个稀释度1～3*10-。3、追加培育液第三天，吸去带有病毒的培育液，在每个孔中再参与100ul完全培育液，以利于细胞的生长。4、观看结果并计算滴度第五天，在荧光显微镜下观看结果。滴度〔PFU/ml〕=细胞数*荧光百分比*MOI*病毒稀释倍数*1033：汉恒生物目的细胞慢病毒感染复数〔MOI〕与体积对应表规格 大约数目 MOI值

量

慢病毒 MOI摸索时参与的体积梯度/ul96well

20-50

0.4-2.5×106

4-25ul 4；12；2048well

20-50 0.2-1×107 20-100ul 20；60；10024well

20-50

0.4-1.5×107

40-150ul 40；120；20012well

20-50

100-250u 100；300；500l6well

20-50 0.2-1×108 0.2-1ml 200；600；100035mmdish

20-50 0.2-1×108 0.2-1ml 200；600；100060mmdish

20-50 0.4-2×108 0.4-2ml 400；1200；2023100mmdish

20-50 1.2-5×108 1.2-5ml 1200；3600；6000150mmdish150mmdish1-2×10720-500.2-1×1092-10ml2023；6000；10000慢病毒滴度以108/ml为准，其他滴度需相应换算;细胞计数。注：1〕24板长满了细胞大约有3×10570％〔2.1×105〕，1.2－1.4×105个细胞。由于细胞刚放进去的前几个小时需要粘在生长外表及适应的生长条件，不会到达24小时翻一倍的速度。其他规格培育可参照此确定相应culture细胞量。2〕MOIMOI是multiplicityofinfection的缩写，中文译为感染复数,实际的含义最适MOI值有差异前先进展预试验摸索最适MOI。4：慢病毒MOI注：不同试验室由于细胞的来源、代数和细胞状态等因素的影响，MOI值也略有差异，85-100%细胞状态良好的状况下获得的，仅供参考。细胞系名称 细胞描述 MOI值范围

能否添加polybreneK562 人白血病细胞 20～40 可Jurkat 人白血病细胞株 50～80 不行kasumi 人白血病细胞株 10～30 不行NB4 人白血病细胞株 50～80 不行U937 人单核细胞 20～40 可THP-1 人单核细胞株 50～80 可GBC-SD 人胆囊癌细胞株 30～50 不行H929

人多发性骨髓瘤症细胞系

100～150 不行H1299

人非小细胞性肺癌细胞

1～3 可95D 人肺巨细胞癌 2～4 可A549 人肺腺癌 20～40 可SPC-A-1 人肺腺癌细胞 100～150 可7402 人肝癌细胞 10～15 可Hep3B 人肝癌细胞 10～30 可HepG2 人肝癌细胞 10～30 可SMMC-7721 人肝癌细胞 10～30 可Huh-7 人肝癌细胞系 10～30 可Hela 人宫颈癌细胞株 10～30 可HOS 人骨肉瘤细胞系 20～40 可Hep-2 人喉癌细胞株 10～30 可HL-60

人急性髓系白血病细胞株

>100 可HT-29 人结肠癌细胞 10～30 可PKO 人结肠癌细胞 2～4 可SW480 人结肠癌细胞株 10～30 可DLD-1

人结直肠肿瘤细胞株

10～30 可SK-OV-3 人卵巢癌细胞株 2～4 可SHG-44 人脑胶质瘤细胞 10～30 可U251

人脑胶质母细胞瘤

1～3 可U87

人脑星型胶质母细胞瘤

1～3 可293T 人胚肾上皮细胞 1～3 可HUVEC-2C

人脐静脉血管内皮细胞

10～30 可PC-3 人前列腺癌细胞 20～40 可MDA-MB-231 人乳腺癌细胞 10～30 可MCF-7 人乳腺癌细胞株 20～40 不行Tca8113 人舌鳞状细胞癌 10～30 可RPE

人视网膜色素上皮细胞

10～30 可AGS 人胃癌细胞 100～150 可BGC-823 人胃癌细胞 100～150 可SGC-7901 人胃癌细胞 10～30 可MKN-28 人胃癌细胞株 20～40 可MKN-45

人胃低分化腺癌细胞株

20～40 可BxPc-3 人胰腺癌细胞 20～40 可CFPAC-1 人胰腺癌细胞 50～80 可Panc-1 人胰腺癌细胞 2～4 可HEC-1-B

人子宫内膜癌细胞株

2～4 可NIH-3T3

小鼠成纤维细胞系

20～40 可Raw264.7

小鼠单核巨噬细胞白血病细胞

不行化〕CHO

中国仓鼠卵巢细胞

20～40 可HSC-T6 大鼠肝星型细胞 10～30 不行大鼠脑胶质瘤细C6胞

>100 可NRKNRK大鼠肾细胞10～30可腺病毒慢病毒逆转录病毒腺病毒慢病毒逆转录病毒感染方式直接参与直接参与直接参与换液时间2h24h24h是否需要筛选不需要腺病毒感 需要筛选获得 需要筛选获得染力气很强 稳定感染株慢病毒稳定感染株逆转录的感染力气不强 病毒的感染力气不强观看时间如带有GFP等荧 带有GFP等荧光 带有GFP等荧光光标签，24h24h后可以观标签，24h到荧光，36h36h到达察到表达，36h标签，则需要鉴定标签，则不行直接观标签，则不行直接观察到，需要鉴定察到，需要鉴定是否需要助转剂不需要有时需要但是 有时需要但是依据具体状况操作，依据具体状况操作，因为助转剂，如因为助转剂，如polybrene，对细胞 polybrene，对细胞的损害比较大有的的损害比较大有的细胞可能承受不了 细胞可能承受不了6：汉恒生物病毒包装周期表腺病毒 慢病毒过表达 干扰 过表达 感染列获得

3～5天 2～4天

列获得

3～5天 2～4天粒构建

3～12天 3～12天

达质粒构建

8～12天

8～12天组

5～10天 5～10天

包装

5～10天

5～10天包装

12～15天

12～15天

缩〔可选〕

1～2天 1～2天增

12～15天

12～15天

定

3～5天 3～5天〔可选〕