两栖类离体标本的制作

实验二、两栖类立体标本的制作121140052王哲迪一、 实验目的1、 急性实验，离体标本制备2、 细胞内/试管内，在体/离体区别3、 内环境、任氏液4、 手术器械的正确使用二、 实验原理1、 急性动物实验与慢性动物实验急性动物实验可分为离体和在体实验两种方法。离体实验：是从活着的或刚处死的动物身上取出所需要的器官、组织、细胞或细胞中的某些成分。置于一个能保持其正常功能活动的人工环境中，观察某些人为的干预因素对其功能活动的影响。例如，对离体蛙心或动物血管条进行灌流，可用于研究某些生物活性物质或药物对心肌或血管平滑肌收缩力的影响；应用膜片钳技术可研究细胞小片膜上单个离子通道的电流特性。在体实验：是在动物麻醉条件下，手术暴露某些所需研究的部位，观察和记录某些生理功能在人为干预条件下的变化。例如，以动脉插管记录动物血压，可用于观察某些神经或体液因素对血压的影响；将玻璃微电极插入脑内某些部位进行细胞外或细胞内记录，观察神经元在接受某些刺激时放电活动的变化，以了解这些神经元的生理功能。急性动物实验的优点是实验条件比较简单，条件较易控制，便于进行直接的观察和细致的分析；离体实验则更能深入到细胞和分子水平，有助于揭示生命现象中最为本质的基本规律。慢性动物实验：慢性动物实验以完整、清醒的动物为研究对象，且尽可能保持外界环境接近于自然，以便能在较长时间内观察和记录某些生理功能的改变。实验前一般需对动物作某些预处理，待动物康复后再进行观察。慢性动物实验适用于观察某一器官或组织在正常情况下的功能以及在整体中的作用地位，但不宜用来分析某一器官或组织细胞生理功能的详细机制。与急性动物实验相比，慢性动物实验的干扰因素较多，实验条件较难控制。2、 蟾蜍作为生理学实验模式生物的优点两栖类动物生存环境较简单，离体组织或器官所要求的条件也较简单。坐骨神经和腓肠肌属于可兴奋组织，把它们置于人工配制的任氏液中，其兴奋性在几个小时内保持不变。若给坐骨神经一个适宜的刺激，可在神经和肌肉上产生一个可传导的动作电位，肉眼可以看到一次肌肉的收缩和舒张，表明神经和肌肉兴奋了一次。三、 动物与器材1、 实验动物：蟾蜍4只/组2、 实验用具：毁髓针、锌铜弓、解剖盘、玻璃分针、培养皿、烧杯、蛙板、蛙钉等。3、 实验试剂：任氏液四、 方法与步骤1、 双毁髓左手握蟾蜍，背部向上。用食指按压其头部前端，拇指压住躯干的背部，使头向前俯；右手持毁髓针，由两眼之间中线向后方划触，触及两耳后腺之间的凹陷处即是枕骨大孔的位置。将毁髓针由凹陷处垂直刺入枕骨大孔，然后针尖向前刺入颅腔，在颅腔内搅动，以毁脑组织。再将毁髓针退全枕骨大孔，针尖转向后方，与脊柱平行刺入椎管，以捣毁脊髓。脊髓彻底捣毁时，可看到蟾蜍后肢突然蹬直，然后瘫软，此时的动物为双毁髓动物。2、 剪除躯干上部及内脏用骨剪剪断脊柱，然后往后肢方向撕剥皮肤。左手握住蟾蜍下肢，大拇指抵住脊柱尾骨，右手用粗剪刀沿脊柱两侧剪开腹壁。此时躯干上部及内脏即全部下垂。剪除全部躯干上部及内脏组织，弃于烧杯内。3、 剥皮左手持镊子夹住脊柱，右手捏住皮肤边缘，向下牵拉剥离皮肤。拉至大腿时，如阻力较大，用力剥。将全部皮肤剥除后，用任氏液洗净标本。然后洗净双手和用过的全部手术器械，再进行下列步骤。4、 分离坐骨神经将一侧后肢的脊柱端腹面向上，用大头针将标本背位固定于蛙板上。用玻璃分针沿脊神经向后分离坐骨神经。股部沿腓肠肌正前方的股二头肌和半膜肌之间的裂缝，纵向分离暴露坐骨神经的大腿部分，直至分离全胭窝胫神经分叉处。完全暴露坐骨神经。5、游离腓肠肌5、游离腓肠肌在腓肠肌跟腱下穿线并结扎，提起结扎线，剪断肌腱与胫腓骨的联系，游离腓肠肌。6、 检查标本将制备好的标本浸泡到任氏液中5-10min，待其功能稳定后，用任氏液沾湿的锌铜弓的两极接触神经，如腓肠肌迅速发生收缩，则标本机能正常。五、结果与分析

上面这张图里并没有显示出大腿上的坐骨神经，因为坐骨神经在肱二头肌和半膜肌的夹缝里，要用玻璃分针挑起来才能看到，这张图没有挑起来，完全看不到坐骨神经，只能看到腓肠肌和被剪断的肌腱，这一点很失败。但是经锌铜弓检验，标本的机能正常。用任氏液湿润锌铜弓后，锌铜弓接触坐骨神经时腓肠肌迅速收缩。需要注意的是，用锌铜弓检验神经标本机能时，要用玻璃分针挑着坐骨神经，不能用金属的镊子夹着神经，金属器械碰压神经与腓肠肌，会引起肌肉收缩，如果碰的较重，损伤部位及近端的神经就死亡了，以后刺激只能从损伤处向肌肉处之间的部分.另外容易使标本疲劳，失去活性。分离下来的坐骨神经干失去了大量水分，而且神经上还缠绕有少量血管，分离的不干净，这一点不成功。但是神经十一直分离到了脚趾都没有断，这一点比较成功。3、 锌铜弓工作原理锌铜弓：在生理学实验中，锌铜弓是检验标本机能活性最常用而简易的刺激器。由铜片和锌片两种金属制成。锌铜弓具有刺激作用，是因为金属与溶液之间产生电位差，即电极电位。通常将金属浸入电解质溶液中，如Zn便溶解而成Zn离子。而在Zn的里面则形成负离子。Cu在溶液中则相反，金属与溶液之间便产生了电位差一一电极电位。如果将Zn和Cu一端接触，则在接触部位电流由Cu向Zn方向流动；而在溶液中则相反，由Zn向Cu流动。当锌铜弓接触组织时（注意：表面必须湿润）电流便沿Znf可兴奋组织fCu方向流动，而产生流动作用。这样，锌铜弓好像一个电池，Zn如同其阳极，Cu好像阴极而发挥作用。神经或肌肉的电刺激阈值非常小，所以仅用锌铜弓接触，即可构成刺激，以便检验组织的机能活性。锌铜弓测试法：做好的标本用锌铜弓的两极轻轻接触坐骨神经，腓肠肌立即收缩，表示标本的兴奋性良好。金属器械接触神经引起肌肉收缩与锌铜弓的差异：神经细胞的静息膜电位为外正内负，如果刺激使膜电位差值减小（去极化），细胞则兴奋。金属器械是导体，而且人也是导体，当手拿着金属器械去接触神经时，神经细胞外表面的正电荷会沿着导体导入大地，使得细胞去极化，所以产生兴奋。4、 电生理对现代生理学的影响电生理学是生理学的一部分，它主要研究活组织的生物电现象和电流对活组织所产生的生理影响。电生理学对现代生理学发展起着重要的作用。膜片钳技术（patchclamprecordingtechniquss）是1976年由Neher和Sakamann共同创立的〔1〕，它是一种以记录通过离子通道的离子电流来反映细胞膜上单一的（或多个的）离子通道分子活动的技术。该技术能分辨通过细胞膜单个通道的电流,从而可以对通道的电导及其动力学特性、药理学特性、以及通道的调节机制开展深入的研究，并为通道的分型提供可靠的新的标准，进而发现并区分出了许多新的通道类型。另外，膜片钳技术可准确监测出微小的与细胞分泌有相关性的膜电容的变化〔2〕，因而它还是一种研究细胞分泌机制的电生理新方法。因而此技术被认为与基因克隆技术并驾齐驱，给生命科学研究带来了巨大的前进动力。Neher和Sakamann因此荣获1991年度的诺贝尔医学和生理学奖。膜片钳技术与其他技术结合运用可以研究解释生命活动的许多现象。例如，almer和Neher用膜片钳技术与Fura-2显微荧光测钙技术的结合观测荧光强度〔3〕进而分析研究细胞内钙化离子浓度与细胞分泌之间的关系时，发现细胞内游离钙离子浓度的变化（生理范围）在嗜铭细胞或神经细胞的分泌中起重要调节作用，而在肥大细胞中的分泌却无明显作用。总之，随着膜片钳技术的进一步完善及与其它技术有机结合的发展，它们在生命科学研究中的应用必将越来越显示其威力。5、 规范使用手术器械的意义只有按照规范使用手术器械完成实验才能提高技术操作水平。规范使用手术器械可以降低器械的损耗程度。正确使用手术器械才能得到正确的实验结果。正确使用手术器械还可以避免对人造成伤害。六、 参考文献1、徐涛等 细胞膜离子通道电流及胞内钙离子浓度同时定量检测 武汉大学学报，1995,2:24—282、 JaffeL,HagiwaraS,KadoR.Thetimecourseofcorticalvesiclefusioninseaurchineggsobservedasmembra