犬瘟热细胞生物学与分子生物学诊断方法

犬瘟热细胞生物学与分子生物学诊断方法

狗瘟疫（cd）是由副粘病毒科麻醉性病毒（cdv）引起的急性高度接触性传教士疾病。该病毒为一种嗜神经、嗜白细胞性单股负链RNA病毒。伴随生态环境的改变、动物和病毒的进化以及对犬瘟热诊断技术的日益完善,发现CDV自然感染的动物范围不断扩大,危害也越来越严重,致病地位日益突出,但在临床上犬瘟热的诊断很困难,易与上呼吸道感染、犬传染性肝炎、犬冠状病毒感染等相混淆,因此,本文就犬瘟热的诊断方法进行综述。1病毒分离成功率低CDV分离培养是确诊本病最根本的方法,但工作量较大,加之CDV对外界环境的抵抗力很弱,其脂质囊膜结构较脆,易被光和热灭活,致使病毒分离成功率较低。此外,病料采样的部位、时间、样品处理、病程类型、发病动物的抗病毒抗体水平等因素对病毒分离成功与否有一定的影响,但最主要的是分离病毒的细胞是否敏感和有效(如病毒的细胞受体蛋白在细胞中含量很少,且细胞在不同周期表达的受体量有差异等)。分离CDV用的组织细胞有原代细胞及传代细胞系两大类。1.1cdv对鸡胚毛尿囊膜的免疫作用原代培养细胞有犬或貂的肺和腹腔巨噬细胞、肾细胞、胚胎细胞、外周血淋巴细胞、T淋巴细胞、犬脑细胞(DB),犊牛的肾细胞和T淋巴细胞,牛胚胎肺细胞和鸡胚成纤维细胞(CEF)。CEF应用最多,细胞病变(CPE)包括星芒状和露珠样病变或细胞颗粒变性和空泡形成,在覆盖的琼脂下可形成微小的蚀斑,Haig(1948)将适应于雪貂的CDV株(Onderstepoort)培养于鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)上获得成功。本病毒可在6～11日龄CAM上发育,一般经过3～10代后,于接种后2～7d出现肉眼可见的病变,CAM水肿,形成灰白色增厚的痘斑,但强毒在CAM上的痘斑形成效率最低。最有效的方法是用幼犬或雪貂的肺脏巨噬细胞进行培养。Vantsis(1959)用感染动物的肺巨噬细胞直接培养,可以频繁地分离出病毒。没有母源抗体的易感幼犬的肺巨噬细胞对该病毒最易感,可形成典型CPE,强、弱毒株都能使犬肺巨噬细胞培养物发生细胞融合而形成巨细胞,用H.E.染色在合胞体巨细胞的胞浆内含有嗜酸性包涵体,通过免疫荧光(IF)技术可检查到包涵体内存在着病毒抗原。钟志宏等(1995)通过制备犬肺巨噬细胞(DLM)及其对不同毒力CDV的敏感性比较,得出CDV对犬和水貂的毒力并不总是与该病毒在DLM上的感染和复制能力相一致的结论。与犬巨噬细胞培养物相比,雪貂或犬肾细胞用于强毒分离的敏感性较低,因此,利用肾细胞从CDV感染犬分离病毒可能有限。1.2在信息化细胞中分离分离CDV的传代细胞系有犬肾细胞系(MDCK)、狗肾细胞系(DK)、猫胚胎细胞系(FE)、猫肾细胞系(CRFK)、乳仓鼠胎肾细胞系(BHK-21)、非洲绿猴肾细胞系(Vero)及其克隆株(VeroE6)、BGMK(GreenMonkeyKidney)细胞系、绒猴B淋巴细胞系(B95a)、人子宫颈癌细胞系(Hela)、人喉头癌细胞系(HEP-2)、CV-1(TC7clone)细胞系、Bsc-1细胞系、兔肾细胞系(RK13)、BD细胞系等。近年来,用Vero细胞分离培养CDV很有希望,被认为是首选细胞。Vero细胞接种后可逐日观察到细胞变圆,胞质内颗粒增多,胞浆空泡化,部分细胞坏死脱落,使单层细胞呈现拉网状,融合细胞如蜘蛛样匍匐于网中。在用传代细胞单层培养病毒时,细胞形成单层的时间不宜过长,否则影响对病毒的敏感性,另外,CDV用传代细胞系传代,易使毒力下降或细胞病变丢失。1.3治疗及并发症CDV分离成功后,还需通过动物回归试验对该病作进一步确诊。各种接种途径均可使雪貂、犬和水貂发生具有临床症状的感染,但该病最敏感的实验动物是雪貂,接种后其死亡率可达100%。2磷硫酸和pta的染色本法是检查、确定CDV感染最简便快速的方法。制备电镜样品方法有磷钨酸(PTA)负染色法、液相免疫电镜和超薄切片法。根据笔者的经验,电镜观察的最佳病料是粪便,该诊断法从制样到镜下观察,整个过程只需要2～3h,可用于快速检查CDV粒子。3细胞内面包体的免疫特征在CDV感染的细胞中出现一种特征性的形态学变化——包涵体(inclusionbody)。这是CD感染的重要标志之一,可通过诊断病理学进行检查,这是诊断CD的重要辅助方法。生前采取鼻黏膜、眼结膜、膀胱刮取物、阴道黏膜或外周血液等制成涂片,检查细胞的胞浆内包涵体和核内包涵体。包涵体经H.E.染色后,在光学显微镜下可见其呈红色或暗红色、具有清晰的边界和匀质的边缘。通常多见于细胞浆内,一个细胞中常可发现1～10个多形性包涵体,一般呈圆形或椭圆形,也有见到呈镰刀形而紧贴于胞核上者;存在于核内的包涵体属于CowdryA型。对病理组织及组织培养细胞采用免疫荧光技术可以证明包涵体内含有病毒抗原。特征的组织变化为下列细胞有胞浆和/或胞核内包涵体:呼吸道:鼻和咽喉部黏膜上皮内有特征的胞浆和核内包涵体,核内包涵体与胞浆内包涵体相似,仅引起细胞核的轻度肿胀。肺:在巨细胞、单核细胞、细支气管和支气管黏膜上皮细胞有胞浆内包涵体,但核内包涵体较少见。皮肤:上皮尤其皮脂腺上皮细胞有核内或胞浆内包涵体。胃肠道:上皮可能有大量胞浆内包涵体和一些核内包涵体。肝:肝细胞变性和坏死,胆管上皮有核内包涵体。泌尿道:上皮细胞内有胞浆内和核内包涵体。中枢神经系统:在胶质细胞内常有胞浆内和核内包涵体。神经细胞也会发生退行性变化。在神经细胞内,很少见到包涵体。脑膜动脉和静脉的内皮和外膜细胞、皮质和脉络丛毛细血管的内皮细胞、血管腔的单核细胞、蛛网膜腔的组织细胞和巨噬细胞、增生的小胶质细胞和室管膜细胞中,均可见类似犬瘟热病毒衣壳的晶状结构。视网膜:在视网膜和视神经的胶质细胞有核内包涵体。另外,在病犬外周血液中的中性粒细胞和单核细胞有核内包涵体。而淋巴细胞内的包涵体则比较少见。有时关节上皮也有包涵体。在慢性病程中,很少出现包涵体。4抗cdv特定菌株的检测4.1检测病毒抗原任文陟等(1994)用CD鸡胚成纤维细胞弱毒疫苗免疫绵羊制备琼脂扩散抗体,用CD病貉肝脏制备琼脂扩散抗原,建立了琼脂扩散试验方法,用于CD病死动物肝、脾脏器中病毒抗原的检测。初步检测送检病料10份,并与电镜检查结果比较,阳性符合率为85.7%(6/7),阴性符合率为75%(3/4),总体符合率为90%(9/10)。4.2协调凝集试验刘鼎新等(1986)用此法检测289份具有CD症状可疑犬的新鲜粪便、肠内容物或高热期的尿液,CD阳性数为109份。4.3mrp-mina染色田克恭等(1998)利用此法在接毒细胞发生病变后进行免疫组化染色,在半数细胞浆中可见棕褐色或黄褐色阳性反应物质。4.4犬身接种过的犬PAP技术可作为CD致死动物的快速可靠的诊断方法,特别是对免疫接种过的犬,更有重要价值。Gathumbi(1994)在肯尼亚用此法检查了30例经福尔马林固定的石蜡包埋切片,对那里的CD作出了确诊。4.5cd最佳检测方法的确立将此技术应用于CDV研究,可解决CD死后快速诊断以及病毒在体内分布等问题。袁书智等(1994)应用直接FA染色法对CD生前与死后的检测,并与电镜、病毒分离及CPE等检测方法进行比较,结果表明,用此法检查外周血液白细胞中的CDV抗原,可作为CDV是否感染的指标以及CD生前和死后诊断方法之一;同时可用于CDV疫苗效价的测定,其测定抗体效价较微量中和试验节省3～4d时间。这对CD的防疫、进出口检疫有重要的意义。5抗cdv特定抗体检测5.1cdv抗体检测采集发病前后两份血清做SN,既可进行临床诊断,又可进行流行病学调查。乔贵林等(1997)采用固定病毒—稀释血清法以CD弱毒和自制的高免犬血清建立了检测CDV抗体的中和试验。本法特异性较强,敏感性较高,稳定性较好,是目前诊断CD和临床上监测犬免疫力的标准方法,但诊断所需要时间较长,工作量较大。5.2cdv近期感染或近期接种试验用抗原多为接毒的CEF和Vero细胞培养物。补体结合抗体一般在CDV感染后21～28d出现,几周后消失,因此查出补体结合抗体,就证明为CDV近期感染或新近按时完成疫苗接种。由于许多犬血清中存在抗补体物质,因此有时会影响试验结果。5.3免疫抗体检测ELISA可用于评估CD的免疫和CD疾病多方面的调查。Noon(1980)、Potgieter(1989)、Bernard等(1982)用间接法检测循环抗体,先将CDV抗原吸咐于固相载体上,随后加入不同稀释度的被检血清,再加酶标记的兔抗犬IgG,最后加入底物显色并判定。ELISA与SN的符合率为97%(265/273),敏感性和特异性分别为95.7%(112/117)和98.1%(153/156)。5.4cd快速诊断法本法主要用于检查患CD动物血清中的抗体,做生前诊断用。刘鼎新等(1986)用本法进行了CD快速诊断的研究,结果表明,此法具有特异、敏感、操作简便、不需要昂贵器材以及样品可长期保存等特点,易于现场应用。5.5cdv抗体完全保护值的比较乔贵林等(1997)在国内首次应用这两种方法对CDV抗体进行定量检测。当以1∶25、1∶100和1∶100分别定为IFAT、间接免疫酶染色法和SN试验测定血清CDV抗体的完全保护值指标时,三者所测血清的完全保护率无显著差异(P>0.05),据此认为,IFAT和间接免疫酶染色法可部分代替SN试验用于CD疫苗免疫效果的评价、免疫犬抗体水平的监测以及CD的流行病学调查。6生物学诊断近年来,随着核酸杂交、聚合酶链式反应(PCR)等技术的应用,CDV的诊断也进入了分子生物学阶段。核酸探针、原位杂交、反转录—聚合酶链式反应(RT-PCR)以及基因序列分析等方法建立之后,就可对病料中是否含有CDV特异性核酸进行鉴定,从而提高了CDV诊断的准确性、敏感性和特异性。6.1cdv基因组结构检测ApplelM.J.(1987,1991)用cDNA探针和单股RNA探针检测了CDV基因组RNA和mRNA获得了很高的灵敏度和特异性,并于1991年用该技术进一步弄清了CDV基因组结构,使CDV的研究从细胞水平进入分子水平。6.2cdv核苷酸序列测定Zurbriggen-A等(1993)用地高辛标记CDVNP基因互补的RNA作为探针,对狗原代脑细胞培养物(DBCC)及脑组织进行原位杂交试验,可检测到单个细胞中存在的CDV核苷酸序列,其敏感性不亚于免疫组织学的检查。Oglesbee(1986)的研究表明,减少核酸探针的长度可以增加原位杂交的敏感性,病毒RNA在裂解的感染细胞中阳性率为90%,而免疫荧光方法仅为70%。6.3cdv的分离培养Yeon-silshin等(1997)以两套引物针对CDVOnderstepoort株NP基因的两个片段,应用RT-PCR技术,检测感染CDV犬外周血液单核细胞(PBMC)中CDVNP基因,并对RT-PCR作为一种诊断方法的意义进行了探讨。李金中等(1999)根据Barret报道的CDVOnderstepoort株F基因序列,在国内首次建立了CDVRT-PCR诊断方法,此法具有高度敏感、特异、准确等优点,成功地应用于临床诊断。何洪淋等(1999)对Genbank中已有的CDVF基因、H基因、L基因的保守序列分析后,设计合成了8条引物对他们分离到的CDV野毒株(LIU)H全基因序列作了测定,并从此获得CDVRT-PCR的又一检测方法。乔军等(2001)用其中一对通用引物成功地进行了狐狸感染CDV的诊断。综上所述,过去对CD的诊断主要依靠电镜观察和病毒的分离培养,但由于