ao工艺mbr处理生活污水中硝化菌群的研究

ao工艺mbr处理生活污水中硝化菌群的研究

硝化菌生长缓慢，对环境因素敏感，因此硝化作用已成为生物脱氮处理的限制性步骤。膜生物装置（mlr）的高效固液分离效应可以将废水过滤，防止生物流失。这是解决传统制备中硝化能力不足的重要方法。近年来,各种分子生物学技术开始应用到环境微生物群落结构分析上。聚合酶链式反应—变性梯度凝胶电泳(PCR—DGGE)作为一种快速、简便的指纹识别技术解决了传统的生物分离培养的难题,也将微生物多样性研究提高到分子水平上。荧光原位杂交(FISH)技术具有快速便捷的特点,可原位检测出活性污泥菌胶团上的硝化菌的分布情况,结合稀释方法,可对环境样品中的硝化菌进行定量分析。FISH技术既可定性,又可对环境中的硝化菌进行直接计数,是研究硝化菌群的空间和数量分布的有效检测手段。笔者采用A/O工艺MBR,以生活污水为处理对象,考察该系统的脱氮特性,并应用PCR—DGGE与FISH分子生物学技术,对系统各个运行阶段的硝化菌群的时空分布进行了分析。1材料和方法1.1生物处理技术实验装置采用A/O工艺MBR生物脱氮系统,流量调整槽+反硝化池和硝化池两部分组成,具体见图1。膜组件的尺寸为285mm×196mm×7mm,膜板是由ABS塑料制成的中空骨架,通过热合方式将膜片与骨架粘结,膜片与骨架间充填厚度1.5mm的无纺布以保证通水性能,膜板顶部为出水口。取城市污水处理厂曝气池成熟活性污泥为接种污泥,以人工模拟生活污水为处理对象。采用间歇抽吸出水(抽10min,停2min),膜下用穿孔管鼓风曝气方式增加硝化池中的DO以及靠膜表面气泡的剪切力减少膜污染。系统稳定运行60d,运行参数为:DO2～4mg/L、pH7.0～7.8、温度20～25℃、HRT8h、日处理量50L、污泥质量浓度2000～6000mg/L、污泥回流比为0.75。1.2检测过程和分析方法1.2.1污泥和废水样品分析在MBR系统运行过程中,分别在1、4、7、10、15、22、27、30、33、38、41、45、48、50、55、60d进行了污泥采样和水质分析。每次分析都对BOD5、COD、NH3-N、NO-3-N、NO-2-N、DO和pH进行检测,TN只在1、7、10、15、22、27、33、38、45、48、55、60d进行检测。对所有水质参数都检测的样品进行了分子检测。1.2.2紫外分光光度法BOD5、COD、TN、NH3-N、NO-3-N、NO-2-N参照美国哈希公司的水质分析方法,采用该公司生产的DR4000紫外分光光度计进行检测。DO、pH采用美国哈希公司的台式多参数测定仪进行检测。1.2.3pcr扩增和分析样品取样后在-40℃中保存。DNA提取采用冻溶+玻璃珠+溶菌酶+十二烷基硫酸钠(SDS)的方法,粗制的总DNA纯化采用凝胶回收纯化试剂盒进行纯化。采用上游引物GC341F(5’-CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGTCCCGCCGCCCCCGCCCGCCTACGGGAGGCAGCAG3’),下游引物EU500R(5’-GTATTACCGCGGCTGCTGG3’)对纯化样品进行16SrDNA的巢式PCR扩增。PCR采用50μL体系,扩增条件为:94℃变性1min,57℃退火1min,72℃延伸2min,30个循环;采用1.5%(质量分数)琼脂糖凝胶电泳对PCR扩增产物进行检验。采用Bio-rad公司生产的DGGE电泳仪对PCR扩增产物进行分析。聚丙烯酰胺变性梯度胶质量分数为8%,变性梯度为45%～70%,温度60℃,电压35V,1×TAE缓冲液中电泳16h后,用SYBRGreenⅠ核酸染色液(1∶10000稀释度)染色10min,然后立即在紫外照射仪上观察并照相。先采用硝化菌通用探针EU500R(5’-ACCGCGGCTGCTGG-3’)(5’端FITC标记),再采用氨氧化菌探针NS0190(5’-CGATCCCTGCTTTTCTCC-3’)(5’端HEX标记),然后同时采用亚硝酸氧化菌探针NIT3(5’-CCTGTGCTCCATGCTCCG-3’)(5’端HEX标记)和竞争性探针CNIT(5’-CCTGTGCTCCAGGCTCCG-3’),均对4%(质量分数)多聚甲醛4℃固定和酒精脱水后的污泥样品进行FISH杂交。杂交条件为:46℃湿盒内杂交2.5h。所有探针最终质量浓度为5ng/μL。杂交后,所有探针在48℃清洗液中严格浸泡20min,之后用DEPC水冲洗清洗玻片。空气风干后,涂上薄层的反荧光退色剂(Citifluor),在MoticBA400T荧光显微镜下进行观察、拍照,并采用MoticFluo1.0软件对图像进行数字分析。2结果与讨论2.1硝化池内tn的去除及变化A/O工艺MBR处理人工模拟生活污水时,系统对TN及NH3-N的去除效果分别见图2(由于10、38d的数据偏差过大,没有进行统计)和图3。由图2可知,进水TN保持在60mg/L左右;系统运行初期,TN的去除率并不是很高,出水TN较高;随着时间的延长,TN去除率逐渐提高,15d(第3次统计检测)后达到85%以上。这是由于系统运行初期,硝化菌自身生长繁殖较慢,同时异氧菌生长繁殖较快,对氨氧化菌的生长起一定的抑制作用。随着系统的运行,硝化菌的数量逐渐增加,TN的去除率逐渐提高,出水TN浓度逐渐降低。由图3可知,进水NH3-N在48d(第13次统计检测)前控制在45mg/L左右,稳定运行后出水NH3-N在1mg/L左右;48d后将进水NH3-N提高到60mg/L左右,出水NH3-N略有提高,在2mg/L左右,NH3-N去除率保持在95%以上。说明本系统对NH3-N负荷具有一定的抗冲击能力。由图4可知,由于进水中不含NO-3-N和NO-2-N,所以系统运行初期,硝化池中NO-3-N和NO-2-N浓度较低;随着系统的运行,水中的NH3-N逐渐转化为NO-3-N和NO-2-N,水中的NO-3-N和NO-2-N浓度逐渐升高,但是由于亚硝酸氧化菌和反硝化菌生长繁殖较氨氧化菌慢,所以当NH3-N去除率稳定在95%时,硝化池中NO-3-N和NO-2-N的浓度继续升高,直到系统运行到30d(第8次统计检测)后,NO-3-N和NO-2-N浓度开始逐渐降低,说明此时系统中的反硝化菌已处于对数生长期。由图5可知,系统运行到48d(第13次统计检测)时,出水NO-3-N和NO-2-N分别稳定在15、5mg/L左右。NO-3-N浓度达到《城市污水再生利用地下水回灌水质》(GB/T19772—2005)的要求,NO-2-N浓度略高。2.2酶反应的结果2.2.1系统发育类菌回复突变实验结果由图6可知,DNA提取、纯化后片段为8000bp左右。由图7可知,硝化菌的16SrDNA的PCR扩增产物片段约为220bp,与预期的DNA片段大小相符。为了考察长期运行过程中系统内硝化菌群的动态变化,对运行各阶段污泥样品进行了DGGE分析,结果如图8所示。虽然DGGE分析中不排除假阳性或假阴性结果,但通常可以假设DGGE图谱中1条带代表1个种,同一图谱中的对应条带的密度可代表此菌种的丰度。由图8可知,各条泳道内的条带数随运行时间的延长呈现逐渐增加的趋势,特别是在系统运行22d后条带数的变化最为显著。一些在运行初期存在的优势菌种并没有随着运行时间的延长而消失,同时又出现了一些新的菌种。除了新菌种的出现外,生物种群结构的另一个变化是,随着运行时间的延长,各菌种的丰度也发上了变化。A、B、C类菌为系统运行初期的优势菌群,以B类菌密度最大,A类菌次之,C类菌密度最小,即B类菌占硝化菌的比例最大,C类菌占硝化菌比例最小。随着系统运行时间的延长,A、B、C类菌的丰度都有所增加,以C类菌最为突出。到系统运行后期,C类菌的条带密度变为最大。同时,也出现了E、F等类新菌种。2.2.2fish检测结果为了确定DGGE图谱中的优势菌种,采用硝化菌中主要菌种氨氧化菌和亚硝酸氧化菌的特异探针对系统各检测时间的污泥样品进行杂交。结合文献的测序结果可以确定:DGGE图谱中A类菌为氨氧化菌,B、C类菌为亚硝酸氧化菌。将不同检测时间获得的FISH图片用MoticFluo1.0软件对图像进行数字分析。对同一时间的样品进行FISH检测时,每个探针杂交的FISH图片都随意选择至少5个视野,然后根据图片的荧光强度和面积对5个视野分析的统计结果,得到该时期氨氧化菌和亚硝酸氧化菌在系统中占硝化菌的比例,结果见图9(FISH检测与DGGE检测对应进行)。由图9可知,氨氧化菌从系统运行初期到最后,始终占硝化菌的25%左右,亚硝酸氧化菌从系统运行初期的35%增长到运行后期的55%左右。3系统的脱氮特性(1)处理进水浓度TN为60mg/L、NH3-N最高达60mg/L的中浓度模拟城市生活污水时,A/O工艺MBR可维持高效的硝化作用,系统稳定运行后NO-3-N和NO-2-N可维持在1