几种dna损伤的生物标记物及其检测方法

几种dna损伤的生物标记物及其检测方法

随着科学技术和工业的发展，人类生产的化学制剂的总量和类型不断增加，并随人类的大量活动进入环境。这些与环境有关的外来化学品统称为异质气味和外来化合物，如农药（饲料、消毒）、多环芳烃、二氯联苯、氯仿、棕榈油、棕榈油、棕榈油、棕榈油、棕榈油、棕榈油、棕榈油、，由于这些污染物的毒性、环境和永久性，它们可以在生物体中积聚，并通过食物链威胁人类健康。评估这些污染物的生物毒性和生态风险是环境科学工作者研究的重点之一。由于实验室中的毒性生物调查（lagoonbia’s一节），由于实验条件和生物类型的限制，很难真正反映出污染物在实际环境中的生物毒性。化学监测方法可以定量地描述环境和水体中的污染物含量，但仅根据含量无法反映这些污染物对生物的毒性。传统的毒性分析方法通常仅限于特定物质的检测。由于自然界中许多污染物含量较低，相互混合，环境复杂，因此必须使用生态毒性法，以生物多样性作为检测指标，对污染水平进行诊断和评价。遗传毒理学的研究重点是探讨外源化学物质在亚致死毒性暴露水平下对生物体遗传物质的毒性作用特点和机理.近20年来,发展和建立了一系列经典的遗传毒物检测方法,如Ames试验、体细胞染色体畸变、姊妹染色单体交换和微核试验等,这为遗传毒性鉴定与评价奠定了坚实的基础.但这些方法本身还存在着一些不足,如金属离子的干扰,易产生假阳性,操作较为烦琐,试验周期较长等.近年来以快速、简便、灵敏为目的的遗传毒性检测方法正在广泛地开展,而生物标记物研究则是其中的研究热点之一.生物标记物是生物机体直接或间接与环境暴露相关的、可测量的细胞、生理、生化、行为、能量、分子或代谢物水平的变化.简单地说,生物标记物是指示环境暴露和有害效应的生物反应,能显示分子或细胞水平的暴露-效应关系,具有专一性、预警性和广泛适用性,并能为环境污染物所造成的暴露或危害提供有效的检测手段,而且在环境污染物的早期诊断和评价方面具有广阔的应用前景.同时,有关的生物标记物还能指示与毒性机理密切有关的毒性动力学变化,将DNA损伤作为生物学的相关终点来评价遗传毒性.本文就环境污染条件下生物细胞内DNA的损伤类型、一些典型DNA损伤的生物标记物及其检测方法作简要综述.1dna分子损伤在正常条件下,所有生物细胞内的基因组是稳定的,其DNA在细胞分裂过程中通过复制,把所有的遗传物质传递给子代,这对确保生物的正常新陈代谢和繁殖是非常重要的.但在环境污染条件下(如化学诱变物、紫外线、电离辐射、细菌及真菌毒素以及代谢过程中产生的活性氧自由基等),由于DNA结构特点及半保留复制特性,可直接或间接地导致生物细胞内的DNA分子损伤.其主要损伤形式为:碱基改变、脱碱基位点、碱基错配、插入或缺失片段、嘧啶联合、DNA加合物、DNA链断裂、甲基化损伤、DNA链内和链间交联等.这些损伤可以是永久的,亦可是可逆的;不仅损害DNA结构的完整性,还影响DNA表达的准确性,从而对生物细胞产生各种遗传毒性或细胞毒性.当体细胞的DNA受损伤时便会引发畸变、突变,进而导致畸形和肿瘤的发生;当生殖细胞的DNA受损时就会引起生殖细胞突变,可以导致两种后果:①突变细胞不能与异性细胞结合,导致胚胎死亡,它发生于子代,为显性,因此这种突变又称为显性致死突变(dominantlethalmutation);②引起遗传性疾病(hereditarydiseases).如果生殖细胞发生非致死性突变,则可以传给后代,引起先天性遗传缺陷,即遗传性疾病,使人类基因库(genepool)受到影响.由于DNA分子微小,直接检测过于复杂和困难,利用生物标记物进行DNA损伤检测是最可行的方法,也是环境污染早期诊断和评价的重要手段.在生物体中,各种DNA损伤机制均有各自特异性的因子和基因组,构成了各自的生物标记物.2污染条件下，一些典型的生物指标可能会导致生物细胞内的dna损伤2.1dna加合物与生物标记物DNA加合物是某些化学毒物或其代谢活化后的亲电活性产物与DNA分子特异位点形成的共价结合物.DNA加合物的位点多在N-7鸟嘌呤,O-6鸟嘌呤,N-1-腺嘌呤或N-3-腺嘌呤.DNA加合物的形成是生物体对外源物质的吸收、代谢和大分子修复等诸多过程的综合结果,是DNA化学损伤的主要形式之一,可干扰DNA合成过程中的碱基配对、复制及损伤DNA的修复,进而影响细胞分裂.形成的DNA加合物若未被修复或被错误修复时,常引起基因突变.突变类型主要是点突变,其中颠换(如G→T、A→T、G→V等)多于转换(如G:C→A:T等).加合热点(hotspot,即基因中易受攻击的位置)区域的突变频率高于非热点序列,同时被损伤DNA分子的修复也受碱基序列、DNA复制速度快慢、加合反应发生于双链DNA的哪条链等因素的影响.DNA复制转录区的加合物比连接区高2~3倍,转录因子与大量DNA加合物之间存在着极强的相互作用,表明DNA加合物不仅导致基因突变,还可能影响肿瘤调控因子的表达.如接触2-乙酰氨基芴后产生的DNA加合物与雌性小鼠肝脏肿瘤的形成存在线性关系.实验证明,鱼对苯并芘和芳香胺的暴露所形成的DNA加合物能够敏感地指示这些有机物的污染状况.有关水环境的多项野外研究表明,水生动物肝脏的DNA加合物与污染物之间存在着明显的剂量-效应关系.表明DNA加合物可作为有机污染环境中DNA损伤的生物标记物.DNA加合物指示的是污染物对遗传物质的影响.开展此类生物标记物的研究,了解化学毒物的遗传毒理性质,对于从本质上评价生物在环境胁迫下的生长发育及种群的生态变化,都具有积极意义.因此,借助生物标记物进行遗传毒理学研究将成为生态毒理学的一个新方向.由于DNA的重要生物学意义,使DNA加合物的研究近年来倍受重视.定量测定DNA加合物即可初步判定样品的遗传毒性.DNA加合物的测定方法主要有免疫法、荧光测定法、32P-后标记法、碱洗脱法、DNA序列测定法和色谱-质谱法.色谱-质谱法的分离原理是根据复杂样品中的各组分在流动相和固相之间具有不同的分配系数,当两相作相对运动时,各组分便在两相中进行溶解、吸附、脱附的反复分配,最终达到彼此分离的结果.这种色谱分离技术与适当的检测手段(如电化学检测器等)相结合时,就构成了色谱分析法.在色谱仪与光谱仪所组成的联用仪中,以色谱仪作为分离手段,以光谱仪作为分析工具,在分析中取得了相得益彰的效果.当前最成熟的联用仪是色谱-质谱联用仪.该法的优点是灵敏度高(10-14mol)、特异性强、用于检测极微量DNA加合物的存在及研究其形成机理.毛细管气相色谱与质谱联合分析是目前灵敏度最高的技术之一,但由于被修饰的碱基、核苷和核苷酸一般难以充分气化,所以必须使被检物衍生成为具有良好的挥发性或热稳定性,多采用三氟乙酰化物和乙酰五氟苯基化合物等作为疏电子衍生物.目前已研制出毛细管区带电泳分离与质谱联用技术,并被应用于DNA加合物的分离和检测.2.2dna类核和电泳检测单细胞凝胶电泳技术(singlecellgelelectrophoresisexperiment,SCGE)是由Ostling等首创,后经Singh等进一步完善并逐渐发展起来的一种快速检测单细胞DNA损伤的新技术.环境中的物理因素(如电离辐射和紫外线)及化学因素(如细菌及真菌毒素、重金属及有毒有机化学污染物质等)等均可引起DNA单链断裂(singlestrandbreak,SSB).虽然偶而的SSB不会影响双链DNA分子的连续性,但是会引起遗传物质损伤并影响DNA的遗传行为.检测DNA链的断裂是测定DNA损伤程度并判定生物遗传毒性的有效技术.SCGE的原理是:在正常情况下,DNA双链以组蛋白为核心形成核小体;如果去污剂进入细胞,核蛋白被浓盐提取,DNA便形成残留的类核;如果类核中DNA断裂,便会引双螺旋松散,电泳时DNA断片向阳极移动,形成光亮的头部和尾部,形似彗星,故又名彗星试验(cometassay).DNA受损伤越严重,产生的断片亦愈多,其断片也就愈小,在电场中移动的DNA量多,移动距离长,表现为彗星尾长增加和尾部荧光强度增强,从而定量地测定单个细胞中DNA损伤的程度.此过程主要包括以下5步:制片;裂解细胞;电泳;EB染色及图象分析.Wozniak等以人体淋巴细胞为材料,发现随着铅处理浓度的增加,彗星尾长延长,表明铅对DNA断裂造成了明显损伤.类似的结果在醛类污染物中也得到证实.Olive等报道,彗星尾长与SSB数目相关,但当辐射剂量加大时,尾中荧光强度更能反应断裂频率,如断裂DNA数目变化4倍时,其尾长仅变化21%,而尾中荧光强度几乎增加一倍.Ptacek等认为,DNA损伤程度与辐射剂量之间存在剂量-反应关系.近年来,利用图像分析软件,通过测定彗星尾部的荧光强度、尾部长度等参数,计算尾相(tailmoment,尾部DNA量×尾部长度),后者能更好地定量反映DNA损伤,它不仅有DNA迁移距离的指示,还有DNA从头部迁移出量的表示.Kent等人使用这一技术分别检测了烟草幼苗细胞和CHO-K1细胞的DNA损伤,发现尾相随辐射剂量呈线性增加,从而判断DNA损伤程度.随着图像系统的发展和完善,目前又出现了中位分子长度(medianmolecularlength,MML)分析技术,即通过图像软件作出电泳图谱在迁移距离上的吸光曲线,然后求得其一半曲线下面积所对应的迁移距离,或应用该图像软件求出彗星头部(未迁移部分)和尾部(迁移部分)DNA的量并求比值,以判定细胞DNA的损伤程度.Christoph以该方法测定多氯联苯对太阳鱼(sunfish)DNA的损伤量,发现当DNA在一定范围(0.1~0.5μg)内,MML与多氯联苯浓度之间呈现出剂量-效应关系.上述结果表明,彗星长度、尾相及MML变化可作为检测污染物遗传毒性效应的生物标记物.2.3fish的基本原理由于基因位于染色体上,染色体畸变的实质是DNA序列的改变.近年来,染色体畸变一直是生态毒理学家广泛研究的热点之一.随着分子生物学技术的发展,国内外正致力于研究新的检测染色体畸变的方法,原位杂交(insituhybridization,ISH)就是其中的一种,它是由Gall等和John两个小组于1969年发明的.荧光原位杂交是20世纪80年代在原位杂交基础上建立起来的一种高度灵敏、特异性好及分辨率强的染色体和基因分析技术.其基本原理是:通过荧光标记的各类DNA和RNA探针与组织、细胞或染色体的DNA在玻片上进行杂交,在不改变其结构的情况下,对细胞内DNA、RNA某特定序列进行测定.检测时,荧光素被紫外线激发放出荧光后,再在荧光显微镜下直接观察.FISH可用于基因定位、基因突变诊断、染色体结构畸变和数目改变分析.其基本过程包括:制备和探针标记,染色体原位杂交,荧光检测,染色体显带,荧光显微镜检测.FISH已广泛应用于检测细胞染色体从断裂、易位、环及重组等细小及复杂的结构畸变.染色体双链断裂后的重组可分为两种类型:稳定型和不稳定型.双(多)着丝点染色体、环形染色体及断片等不稳定型染色体畸变常引起细胞死亡,而细胞能够容忍易位及倒位等染色体稳定型畸变,并通过有丝分裂而持续稳定的存在.Maluszynska等人以遗传背景清晰的毛还阳参(Crepiscapillaris,2n=6)为材料,使用FISH试验方法检测染色体畸变,结果表明,FISH可准确地检测和定位不稳定型染色体重组,而且还证实根尖细胞的染色体畸变对环境污染具有较好的预警作用.类似的染色体畸变结果在遭受核污染的田鼠细胞中也得到证实.1,2,4-三氯苯、农药、辐射及重金属等均能诱发蚕豆根尖细胞染色体畸变,而且随着处理时间或剂量的增加,染色体畸变率升高;上述污染物与蚕豆根尖细胞染色体畸变率之间存在较好的剂量-效应关系,表明细胞染色体畸变率可作为检测污染物毒性效应的生物标记物.2.4rapd图谱扩增1985年,Mullis发明了聚合酶链式反应(PCR)技术,该技术的产生给整个分子生物学领域带来了一次重大的革命,使得环境污染对生物体中某个特定基因的检测与研究成为可能.20世纪90年代随着PCR技术的广泛应用,DNA的多态性可通过体外克隆方法快速、高效、灵敏地检测出来,如PCR-RFLP、SSCP、DDRT、RAPD、RT-PCR、AP-PCR等.其中应用最多的是RAPD(randomamplifiedpolymorphicDNA,RAPD)技术,通常它以10碱基的寡核苷酸序列为引物,对基因组DNA随机扩增来鉴别多态性DNA的过程.其原理是在无需知道被研究生物DNA序列的情况下,以一系列经过优化的寡核苷酸单链为引物,以研究对象的基因组DNA为模板,如引物与模板的某一片段DNA具有互补序列,则二者结合,扩增出DNA片段,反映了基因组相应区域的DNA特性.如基因组DNA序列发生改变而使特定结合位点分别发生变化,将导致PCR产物的改变和电泳图谱特性的变化.每种生物的RAPD图谱为该生物基因组所特有,其随机扩增的DNA多态性按孟德尔方式遗传,因此该RAPD图谱可作为一种有效的分子生物标记物.其主要操作步骤如下:基因组DNA的提取、纯化,基因组DNA的随机扩增,扩增产物的电泳,随机扩增DNA多态性的图像分析.Franck等以苯并芘(BaP)染毒模式动物Daphnia的结果表明,由系列引物扩增得到的DNA片段的RAPD图谱显示出明显的差异,具体表现为RAPD条带的增减或条带光强的明显改变.Conte以模式植物拟南芥幼苗为材料,发现在水溶液及原位工业污染土壤中的重金属暴露条件下,其基因组的RAPD谱带均明显增加;并且随着处理时间的延长,重金属污染胁迫所造成的DNA损伤变化也越明显.类似的实验结果在鱼细胞中也得到证实.Mengoni检测了铜矿污染土壤对奇异麦瓶草(SileneparadoxaL.,石竹科)细胞的DNA损伤变化,发现增加了两个RAPD谱带,并证实该RAPD谱带为铜污染所特有.Atienzar等研究表明,环境污染物诱导生物体细胞内的DNA损伤和突变,后者导致引物结合位点的核苷酸缺失或增加,最终影响DNA片段的图谱;同时认为不同RAPD谱带变化与DNA变化之间具有相互关系.Theodorakis还深入研究了核素污染胁迫对蚊鱼(mosquitofish)的DNA损伤效应,发现暴露组的RAPD谱带明显增加,而且某些RAPD谱带的出现频率很高,这些谱带被称为污染指示带(contaminant-indicativebands,CIBs);并以Southern杂交分析了污染胁迫下不同物种(鱼、鸥、人)的RAPD谱带,发现其CIBs是一致的,认为物种之间的这些CIBs在长度和序列上是保守的.表明RAPD谱带变化对污染胁迫具有预警作用,故可作为检测污染物遗传毒性效应的生物标记物,在环境污染物的生物检测和评价中具有重要作用.Atienzar等人的研究发现,不同污染物诱导的RAPD谱带是相似的,推测其可能起因于DNA损伤热点的结果.该作者还认为,RAPD谱带易受基因表达、细胞代谢过程变化及遗传物质稳定性的影响,同时外界条件亦会影响RAPD方法本身,从而导致RAPD原始数据呈现出较大的离散性.但统计分析根据分子量将数据进行聚类(如将10%的最大谱带和最小谱带删除),对照组与污染组的差别即