分子生物学课件5DNA复制

分子生物学课件5.DNA复制分子生物学课件5.DNA复制分子生物学课件5.DNA复制DNAReplicationRNAProteinTranslationTranscriptionThisistheoriginalcentraldogma,itformsthebackboneofmoleculebiologyandispresentedbyseveralstages:Replication,transcription,processed(ineukaryoticcells,essentiallybysplicing)andtranslation.processedCentralDogmaReversetranscriptionRNAeditingRNAreplicationDNAReplicationRNAProteinTranslationTranscriptionThisistheoriginalcentraldogma,itformsthebackboneofmoleculebiologyandispresentedbyseveralstages:Replication,transcription,processed(ineukaryoticcells,essentiallybysplicing)andtranslation.processedCentralDogmaReversetranscriptionRNAeditingRNAreplication5.DNA复制

DNAReplication

（Duplication）DNA是生物遗传的主要物质基础，生物机体的遗传信息以密码的形式贮存在DNA分子，并通过DNA的复制由亲代传递给子代，遗传信息从DNA转录给RNA，然后再翻译成特异的蛋白质，以执行各种生物功能。5.1DNA复制的特点

TheCharacteristicsof

DNAReplication5-1DNA复制的半保留性DNA复制的半不连续性复制起点(ori区，序列十分保守)RNA引物思考：DNA通过自身复制，怎样维持遗传的稳定，即DNA复制的高度忠实性是怎样实现的？5.2参与DNA复制的酶体系

Enzymesandrelative

proteinsinDNAreplication双螺旋DNA的复制是DNA聚合酶催化的酶促反应过程。实际上，在复制叉进行复杂的DNA复制过程中，还需要其他许多相关的酶和蛋白因子的参与，如DNA解旋酶、DNA旋转酶、DNA单链结合蛋白、引发酶、连接酶、去除RNA引物的酶等。5.2.1DNA聚合酶及其功能

DNApolymerase(pol)

anditsfunctionDNA聚合酶(DNApolymerase)是指以脱氧核苷三磷酸为底物催化合成新DNA链的一类酶。原核和真核生物中都包含有多种DNA聚合酶的活动。只有它们中的一部分是真正参与了复制的；有的时候这些酶叫做DNA复制酶。其它的一些扮演了复制过程中的辅助角色并且或者参与了替换被破坏的序列的DNA合成的修复工作。研究最清楚的是大肠杆菌中的DNA聚合酶，已鉴定了5种不同的DNA聚合酶，分别为DNA聚合酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ。

所有的原核和真核生物的聚合酶都具有同样的合成行为的基本类型。每一个都可以通过在3‘-OH端一次加入一个核苷延伸DNA链，加入链中的核苷是通过和模版DNA的碱基配对来选择的。DNA聚合酶催化的反应

Thecatalysisreaction

以dNTP为底物，释放PPi获得能量Mg2+反应受模板指导在链的3’-OH端延伸延伸方向是5’→3’新DNA与模版链互补5-23’-OH自由端的作用DNA聚合酶需要3’-OH自由端来初始DNA的合成。提供3’-OH自由端的途径一个RNA序列在模版上被合成，RNA链（RNA引物）的3’-OH自由端会被DNA聚合酶延伸。这种方法通常在复制细胞DNA时被使用，也被一些病毒使用。一个事先形成的RNA和模版配对，允许它的3’-OH端被用来引导DNA的合成。这种机制在反转录病毒中被用来引导RNA的反转录。一个引导点在双链DNA中产生。最常见的机制是通过引入一个切口，如同在初始滚环复制，在这种情况下，事先形成的链由新生成的链替代。

一个蛋白质（C-OH）可以直接引导反应，它可以直接向DNA聚合酶提供一个核苷。这种反应有若干病毒采用。DNA聚合酶Ⅰ

DNAPolⅠ1955年，Kornberg在E.Coli中发现DNApolⅠ。分子质量为10.3万道尔顿，单一肽链组成，多肽链中含一个Zn。DNApolⅠ可被水解为一大一小两个片段。大片段：68000U，又称Klenow片段；具有5’→3’聚合酶活性和3’→5’外切酶活性（有校正功能）。小片段：35000U，具有5’→3’外切酶活性，切除小片段DNA/RNA，如切除RNA引物。Klenow片段的结构（右手形状）手掌手指拇指复制忠实性

ReplicatefidelityDNA复制过程中碱基配对受到双重核对：聚合酶的选择作用3’→5’外切核酸酶的作用正确碱基配对错误碱基配对SlowornoDNAsynthesis（几乎没有DNA合成）外切核酸酶作用位点Exonucleaseactivesite错配碱基Mispairedlastbasepairb.Removalofmismatchednucleotides（切除错配碱基）c.ResumeDNAsynthesis（修复DNA合成）DNA聚合酶Ⅲ

DNApolⅢ1970-1971年，Korn.berg和Gefter先后分离出了DNA聚合酶Ⅱ和Ⅲ。DNA聚合酶Ⅲ是由多个亚基组成的蛋白质，亚基很容易解离。全酶由10个亚基构成，含有Zn原子。亚基数目基因功能αεθτγδδ’χψβ2222211114ploC(dnaE)dnaQ(mutD)holEdnaXdnaX*holAholBholCholDdnaN聚合酶活性3’→5’外切酶校对功能核心酶组建核心酶核心酶二聚化依赖DNA的ATP酶,形成γ复合物可与β亚基结合，形成γ复合物形成γ复合物形成γ复合物形成γ复合物两个β形成滑动夹子提高酶持续合成能力夹子装置器DNA聚合酶Ⅲ全酶的亚基组成(βdimer,滑动夹子)(α,ε和θ)(2γ,δ,δ’,χ和ψ,夹子装置器)DNA聚合酶全酶β亚基二聚体构成一个滑动的夹子，夹住DNA分子相对滑动，使聚合酶在完成复制前不脱离模板DNA而持续聚合。DNApolⅢ复杂的亚基结构使它具有更高的保真性(fidelity)、协同性(cooperativity)和持续性(processivity)。长号模型（Trombonemodel）5.2.3DNA连接酶

DNAligaseDNA聚合酶只能催化多核苷酸的延长反应，不能使链的两个末端间共价连接。1976年不同实验室同时发现了DNA连接酶。这个酶催化双链DNA切口处的5’-磷酸基和3’-OH生成磷酸二酯键，反应需要能量。DNA连接酶的催化反应DNAligase+NAD+/ATP↓酶-AMP复合物↓+DNAAMP-DNA↓相邻3’-OH对活化的磷原子发生亲核攻击↓→AMP3’,5’-磷酸二酯键5.2.4引物合成酶

Primase

引物合成酶（Primase）又称为引发酶，基因dnaG的产物（inE.Coli），是一种特殊的RNA聚合酶，以单链DNA为模板合成互补于DNA链的RNA引物，合成方向是5’→3’。不需要特异的DNA序列。引物的长度通常为几个核苷酸至10个核苷酸。5.2.5RNA消化酶

RNase在DNA复制完成时，必须去除RNA引物。这个过程需要RNase（或DNA聚合酶Ⅰ的5’→3’外切酶活性）去除RNA引物，DNA聚合酶填补缺口，DNA连接酶缝合切口。

缺口：失去一段单链称为缺口(gap)。切口：失去一个磷酸二酯键称为切口(nick)。5.2.6拓扑异构酶

Topoisomerase天然环状DNA分子一般以负超螺旋构象存在，易于解链。DNA复制、重组、转录等过程都需将两条链解开，并且生物学过程需要各不相同的负超螺旋程度，可以通过DNA的拓扑结构来调节其功能。DNA拓扑异构体之间的转变是通过拓扑异构酶来实现的。Topoisomerase共有两种类型：TOPⅠ：使双链超螺旋DNA转变为松弛型环状DNA。TOPⅠ在复制叉前一段DNA断开一个磷酸二酯键，使DNA链断开，使得断开的DNA链可绕着另一条完整的DNA链自由转动，最后再由TOPI重新连上磷酸二酯键。影响转录活性。TOPⅡ：使松弛型环状DNA转变为负超螺旋DNA，又称促旋酶。TOPⅡ同时断开DNA的双链，形成暂时的断裂，然后再与一个双链DNA结合封上断口,在复制叉处消除由于DNA解螺旋而产生的超螺旋。与复制有关。大肠杆菌中的DNA旋转酶(gyrase)又称拓扑异构酶Ⅱ(TopoisomeraseⅡ)，由四个亚基组成四聚体α2β2，而真核生物的呈αβ二聚体。5.2.7解旋酶和单链结合蛋白

Helicase&SSB由拓扑异构酶Ⅱ引入的负超螺旋，削弱了复制叉前进产生的扭曲张力，协助DNA解旋酶(DNAhelicase)促进解链，单链结合蛋白(single-strandDNAbindingproteins,SSB)结合产生的单链DNA(singlestrandDNA,ssDNA)上防止出现单链的链间或链内局部退火，保证产生的单链DNA处于稳定状态。DNA解旋酶(DNAhelicase)的作用SSB结合ssDNA原核细胞中SSB同ssDNA的结合是一种协同结合，无序列专一性，是一种静电作用。大肠杆菌的SSB蛋白有4个相同的亚基组成。5.3原核生物DNA复制（大肠杆菌为例）

theDNAreplicationinE.coliDNA合成的生长点即复制叉上分布着各种各样与复制有关的酶和蛋白因子，他们构成的复合物称为复制体(replisome)。DNA复制的过程表现在其复制体结构的变化上。大肠杆菌染色体DNA的复制过程分为三个阶段：起始、延伸和终止。其间的反应和参与作用的酶与辅助因子各有不同。5.3.1DNA复制的起始

InitiationofDNAreplication

所有的DNA复制通常是从双螺旋的特定位置—复制起点开始。DNA复制起点是DNA复制所必需的一段特殊的DNA序列，又称复制原点(origin)。E.coli的Origin的识别特点：三个富含A-T的13bp序列和四个9bp重复序列（DnaA蛋白结合位点）。HUATP+DnaAHumakesDNAbendDnaB(helicase)DnaC(helicaseloader)13bp9bp复制起始分子机制（六个步骤）

DnaA(ATP)Hu识别、结合9bp重复序列；Hu使DNA双链弯曲；DnaB/DnaC蛋白复合体结合解链区；SSB结合单链DNA；DnaB打开DNA双螺旋；DNAprimase/DnaGDNApolⅢ滑动夹子复制起始酶体系：

OriC处的复制起始从一个需要起码6种蛋白质（DnaA，DnaB，DnaC，HU，DnaG，SSB等）的复合物的形成开始。

DnaG合成RNA引物；DNApol结合DNA。DnaB和DnaC蛋白形成一个复合物，其中6个DnaC单体与每一个DnaB六聚体结合。这行成了一个480KD的蛋白复合体，相当于一个半径6nm的球。在oriC处形成的复合物以一个可见的大蛋白颗粒形式被发现.利用电镜可探测到复制原点C处的蛋白复合体。两个可见的复合体都是采用DnaB蛋白抗体标记显示的。蛋白质功能DnaADnaBDnaCHU引物合成酶(DnaG)SSBRNA聚合酶DNA旋转酶(TopⅡ)Dam甲基化酶识别起点序列，解开双链解开DNA双链帮助DnaB结合于起点类组蛋白，促进起始合成RNA引物结合单链DNA促进DnaA活性释放DNA解链产生的扭曲张力使起点GATC序列的腺嘌呤甲基化大肠杆菌起点与复制起始有关的酶与辅助因子5.3.2DNA复制的延伸

ElongationofDNAreplication复制的延伸阶段同时进行着前导链和滞后链的合成。前者持续合成，后者分段合成。协调滞后链和前导链的合成前导链和滞后链上的DNA聚合酶在同一位点起始滞后链前导链DNA聚合酶以相反方向移动并在冈崎片断合成后分开滞后链上的DNA聚合酶相对于DNA有一个位移核心聚合酶和β夹板在冈崎片段合成结束时脱落，并且在起始点重新结合。当一个PolⅢ全酶遇到一个DNA切口时，核心复合物和夹板会从β滑动夹板上脱落。核心可以在别的地方和一个新的β子基重新结合。

5.3.3DNA复制的终止

TerminationofDNAreplication细菌环状染色体的两个复制叉不断向前推移，最后在终止区相遇并停止，该区含有多个约22bp的终止子(terminator)位点。两个复制叉在终止区相遇后停止复制，复制体解体，两个环状染色体互相缠绕，成为连锁体。此连锁体在细胞分裂前必须解开，否则将导致细胞不能分裂而死亡。连锁体终止解链旋转合成解连锁拓扑异构酶Ⅳ变性修复合成连锁体5.4真核生物DNA复制

DNAReplicationinEukaryotes

真核生物DNA复制研究较为详细的主要有猿猴病毒(SV40)、酵母细胞和非洲爪蟾的卵细胞。5.4.1真核生物DNA复制的特点

theCharacteristic真核生物的DNA缠绕在组蛋白核心上，形成核小体真核生物染色体有多个复制起点5-氟脱氧尿苷是真核细胞DNA复制的强抑制剂复制速度较原核生物慢5.4.2真核生物DNA聚合酶

DNApolofEukaryotes真核生物有多种DNA聚合酶。在哺乳动物中分离了5种：分别以α、β、γ、δ、ε来命名。DNApolαDNApolβDNApolγDNApolδDNApolε定位亚基数目外切酶活性引物合成酶活性持续合成能力抑制剂功能细胞核4无有中等蚜肠毒素引物合成细胞核1无无低双脱氧TTP修复线粒体23’→5’外切酶无高双脱氧TTP线粒体DNA合成3’→5’外切酶无蚜肠毒素核DNA合成3’→5’外切酶无蚜肠毒素修复5.4.3真核生物染色

体DNA复制

Eukaryoticchromosome

DNAreplication真核生物染色体DNA的复制严格遵循每个细胞周期DNA只复制一次的原则。并在复制起始前会形成一个前起始复合体(Pre-replicativecomplex,Pre-RC)。复制起点真核生物复制起点称为自主复制序列（ARS），或复制基因（replicator）有一个蛋白复合体可结合其上，称为起点识别复合物（originrecognitioncomplex,ORC或initiator），激活复制的起始。前起始复合体的形成G1期时：ORC(Initiator)识别、结合replicator;多种蛋白共同参与在replicator处形成前起始复合体(Pre-replicativecomplex,Pre-RC)。pre-RC激活复制起始细胞进入S期：pre-RC被Cdk

和Ddk

两种蛋白激酶激活，形成有活性的起始复合体，开始复制。细胞周期对CdK蛋白活性的调控及前起始复合体形成的调节5.4.4端粒复制

Telomerereplication端粒(telomere)真核生物染色体两端具有的特殊结构。真核生物线性染色体在复制后，不能像原核生物那样填补5’端的空缺，从而会使5’端序列变短，而端粒酶(telomerase)可以外加重复单位到5’段上，维持端粒一定长度。

端粒酶是RNA与蛋白组成的一种核糖核蛋白(RNP)复合体，是一种反转录酶，以其所含有的RNA为模板合成DNA端粒的结构。它所含的RNA约长150bp，并约含1-5拷贝的CyAx重复序列，是合成端粒TyGx的模板。5-35.5DNA复制调控

DNAReplicationControlDNA的复制是受调控的。复制的调控发生在起始阶段，从复制原点起始一轮DNA复制，特异蛋白质因子对原点的识别和结合是关键的一步。生物体中所有的细胞都是将基因组复制与细胞周期相互协调，一个细胞周期中DNA复制一次，以阻止DNA的丢失或过剩。5.5.1大肠杆菌中DNA复制调控

DNAReplicationcontrolinE.colil

染色体的复制与细胞分裂一般是同步的，但不直接相偶联；l

大肠杆菌的复制起点由oriC和oriH两种；DNA复制的调节主要发生在起始阶段，一旦开始复制，如无意外受阻，就一直复制到完成；复制子（Replicon）

基因组中一个能被独立复制的DNA片段单位，其中含有复制起驶点。在细菌和质粒DNA中只含有一个复制子。复制子的复制方式取决于发生在起始阶段的内部作用的实质，普遍原则是复制在起始阶段被控制，一旦复制开始，它就会持续下去直到整个基因组被复制，起始率是由调节蛋白与结合位点的内部作用来控制的。甲基化对复制的调控细菌(或质粒)复制原点的什么特征保证了它在每一循环只起始复制一次呢？起始是与一些改变相连，这些改变在复制原点作标记，所以已复制的复制原点与未复制的复制原点能够加以区别吗？

E.Coli中主要是通过对模板链的甲基化来区分新合成的DNA链。模板DNA的oriC

包含GATCCTAG

这一序列的11个拷贝，它是甲基化的靶序列，Dam甲基化酶使腺嘌呤A的N6位置被甲基化。甲基化的DNA复制产生半甲基化DNA，直至Dam甲基化酶将其全甲基化。

一个半甲基化的复制原点不能被用来起始一个复制循环，完全甲基化的复制原点可起始复制，半甲基化的子代复制原点只有恢复完全甲基化状态之后才可被继续利用。多复制子

真核生物DNA复制的调节比原核生物更为复杂。真核生物细胞有多条染色体，每一条染色体上有多个复制起点，是多复制子的复制。在一个分裂周期，每一个复制子的复制起点都只被激活一次。它们通常是只在复制起点作用一次或者通过一个抑制物阻止已经被使用过的复制起点的再次复制。5.5.2真核生物DNA复制调控

ReplicationControl

inEukaryotes系统如何认定任何一个特殊的复制起点是否已经被复制过了，哪些蛋白质元素与此相关？非洲爪蟾（Xenopus）卵细胞具有所有的复制DNA所需要的成分-在孵化开始的几个小时里它们会经历11个分裂周期而没有新的基因表达-它们还可以复制注入卵内的DNA。执照因子(Licensingfactor)它在复制前存在于细胞核内，复制一次后这种蛋白或者失效或者完全被破坏；除非再提供这种因子，否则就不能进行下一轮的复制。在细胞质中的因子只有在下一个有丝分裂时，当核膜破裂时才能有机会进入核内。这个调控系统达到了两个目的。通过在复制之后去除一个必要的成分，阻止了一周期内的多次复制；而且它提供了反馈循环，使得复制的初始化依赖于细胞分裂的发生。执照因子/特许因子

(Licensingfactor)它在复制前存在于细胞核内，复制一次后这种蛋白或者失效或者完全被破坏；除非再提供这种因子，否则就不能进行下一轮的复制。在细胞质中的因子只有在下一个有丝分裂时，当核膜破裂时才能有机会进入核内。复制由时间控制，并非所有起点都在同一时间被激活，而是有先后。通常活性区先复制，异染色质区晚复制。真核生物没有复制终止子。真核细胞DNA复制有三个水平的调控：细胞生活周期水平的调控—决定细胞停留在G1期还是进入S期。染色体水平复制调控—决定复制子按一定顺序在S期起始复制。复制子水平调控—决定复制起始与否。Summary

DNA是生物遗传的主要物质基础，生物机体的遗传信息以密码的形式贮存在DNA分子，并通过DNA的复制由亲代传递给子代，遗传信息从DNA转录给RNA，然后再翻译成特异的蛋白质，以执行各种生物功能。DNA复制的特点：DNA复制的半保留性、DNA复制的半不连续性、复制起点、RNA引物、双螺旋DNA的复制是DNA聚合酶催化的酶促反应过程。DNA聚合酶不能够从自由的核苷开始初始化DNA链的合成，总是需要一个引物提供一个自由的3’-OH端，才可以加入新的核苷。可以通过多种途径位DNA聚合酶催化地反应提供自由的