PCR实验流程 及遗传性分子诊断试验

遗传性疾病的PCR诊断

——α-地中海贫血的诊断生物化学与分子生物学教研室周娟threesteps:HowPCRworksDenaturation

(变性):90～97℃Annealing

(退火):45～65℃Extension

(延伸):

around72℃1234522557294时间（min）温度（℃）适温延伸3高温变性1低温退火2重复1~3步25~30轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性子链延伸DNA加倍DNA变性形成2条单链PCR的基本原理模板DNA95℃PCR反应过程95℃95℃50℃引物1引物2DNA引物PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点50℃引物1引物2DNA引物72℃Taq酶Taq酶PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点72℃第1轮结束95℃第2轮开始PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点95℃50℃72℃TaqTaqTaqTaqPCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点72℃第2轮结束PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点模板DNA第1轮扩增第2轮扩增第3轮扩增第4轮扩增第5轮扩增第6轮扩增LastStep:72

℃5-10minAfter25~30cycles?30轮循环扩增量达230个拷贝（109拷贝）PCR产物每轮循环增加一倍30次循环后靶序列扩增的数量No.of No.AmpliconCycles CopiesofTarget1 22 43 84 165 326 6420 1,048,57630 1,073,741,8241cycle=2Amplicon2cycle=4Amplicon3cycle=8Amplicon4cycle=16Amplicon5cycle=32Amplicon6cycle=64Amplicon7cycle=128Amplicon

总体积25-100lBuffer(Mg2+)

缓冲液dNTP原料Primer引物DNA分子模板Taq酶DNA聚合酶

PCR的体系组成5

EssentialComponentsofPCRReaction

salts(ions)dNTPsPrimersDNAPolymeraseTemplateDNAPCR在临床上的应用

在遗传学疾病上的应用：地中海贫血在肿瘤研究中的应用检测病原体基因分型地中海贫血地中海贫血是一种常染色体遗传性溶血性贫血,是世界上最常见和发生率最高中的一种单基因遗传病。

地中海贫血是由于珠蛋白肽链合成障碍所致，出现一种或几种珠蛋白肽链数量不足或完全缺乏，从而造成这种珠蛋白链参与的血红蛋白合成量的减少。各珠蛋白链本身的氨基酸顺序并无异常。地贫是严重致死、致残性遗传性血液病常染色体隐性遗传病受累基因：

地贫-

珠蛋白基因（16p13.3）

β地贫-β珠蛋白基因（11p15.3）地贫的病理基础

α地贫：α珠蛋白基因缺失或缺陷使α珠蛋白链的合成受到部分或完全抑制，造成α链的合成减少，过剩的β链聚合成四聚体，在红细胞内沉积，使红细胞变形性降低，不易通过微循环及脾窦与脾索间的基膜而造成红细胞的过度破坏。β地贫：β珠蛋白基因突变导致β珠蛋白链合成受到部分或完全抑制，过剩的α链聚合成不稳定的四聚体，在红细胞内沉积，造成无效造血和红细胞的过度破坏。地中海贫血是全球最大的单基因遗传病之一中国南方不同高发地区人群携带率1~23%中国南方α和β地贫的人群携带率

地区携带率(%)

地贫β地贫广东8.532.54

广西

14.95

6.78四川1.922.18贵州—4.72台湾4.201.10香港5.023.41地贫纯合子：致死性出生缺陷重型地贫:胎儿水肿综合征

早产死胎或出生前后死亡

可导致严重产科并发症

无理想治疗方法重型地贫

出生后1年内发病

多于未成年前因严重贫血而夭折

输血和去铁治疗可维持,代价昂贵操作步骤1.DNA的制备2.建立PCR体系3.PCR扩增4.琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物①正常α珠蛋白基因（αα/αα）②东南亚缺失型α地中海贫血（-SEA／αα）

①②1.DNA样本2.PCR体系建立（分别建立两个体系）Buffer2.5ul×5=12.5

Mg2+2ul×5=10引物A1B2ul×5=10引物A41ul×5=5引物A91ul×5=5dNTP2ul×5=10DNA模板1.5ul×5=7.5H2O12UL×5=60TaqDNA聚合酶1ul（含1U）3.PCR扩增95℃预变性5min95℃变性30s63℃退火60s72℃