塞来昔布和糖尿病大鼠脑缺血再灌注

2009届硕士研究生论文答辩会研究生：祁学章导师：杨丽教授专业：神经病学塞来昔布对糖尿病大鼠缺血再灌注脑组织NF-κB和COX-2表达的影响

EffectsofcelecoxibontheexpressionofNF-κBandCOX-2indiabeticratswithfocalcerebralischemia-reperfusion

汇报内容一引言二材料与方法三结果四讨论五结论六致谢

引言流行病学调查脑卒中是导致死亡的第二大类疾病，平均每15秒钟就有一个脑卒中新发病例,每21秒就有一人死于脑卒中。每年死于脑卒中人数约150万。缺血性脑卒中约占脑卒中总发病率的70%～80%发病率呈逐年上升趋势多合并糖尿病、高血压、高血脂等研究现状神经系统炎症因子脑缺血引起的炎症反应

是以脑微血管中白细胞聚集并穿过血管壁、浸润脑组织、同时伴有微血管功能紊乱及局部脑组织中液体及蛋白质积聚为标志的急性炎症反应过程。其与脑缺血后的继发脑损伤密切相关。其中,环氧合酶和核因子κB被认为是在神经系统的炎症反应中发挥着枢纽性作用的关键因子。有关于环氧合酶一、环氧合酶的作用二、COX的亚型及作用COX-1诱导产生前列腺素发挥多种生理功能，如保护胃肠粘膜、支持肾脏中的微循环等COX-2正常情况下的表达脑缺血后脑组织中COX-2的表达核因子κB昔布类高选择性环氧化酶-2抑制剂临床应用方面对脑血管和神经方面的作用处于实验阶段塞来昔布不会导致缺血事件的增多。COX-2抑制剂所致的心血管缺血事件发生率是随着每日剂量的增加和应用时间的延长而增加的。

研究的意义脑梗死患者合并糖尿病为临床所常见，糖尿病不仅是脑梗死最常见的危险因素之一，且在脑梗死发作时可明显加重脑损伤本研究用小剂量链脲佐菌素腹腔注射SD大鼠，长期饲养，制作与人类相仿的慢性2型糖尿病模型，利用塞来昔布干预糖尿病大鼠脑缺血-再灌注模型，探索其作用机制，拟为临床上的脑保护治疗寻求理论依据。课题的创新之处首次检测脑缺血再灌注的糖尿病大鼠的脑组织中用塞来昔布干预前后NF-κB和COX-2的表达变化情况，从而明确在缺血再灌注的糖尿病大鼠的脑组织中，它们三者之间的关系和意义

材料与方法实验动物清洁级SD大鼠150只，体重180-200g，购自第三军医大学大坪医院试验动物中心许可证号：SCXK-2007017主要试剂Sigma

辉瑞公司

中杉金桥

中杉金桥

链脲佐菌素

西乐葆

NF-KBp65一抗

COX-2

一抗

主要仪器日本尼康光学显微镜微量电子天平电动恒温水浴箱Leica细胞图像分析仪实验动物分组（200-220g大鼠）1.糖尿病大鼠假手术组（S组5只）2.dIR/NS组（NSIR组20只）3.dIR/Celecoxib低剂量组（LCIR组20只）4.dIR/Celecoxib高剂量组HCIR组20只）SSSNSLCIRHCIR各组分为术后6、12、24、48h四个亚组，每亚组5只分组图示65只糖尿病大鼠

糖尿病动物模型制作

（1）高脂饲料喂养一月（2）大鼠的体重220-250g（3）链脲霉素（STZ）40mg/kg（4）血糖值标准13.5mmol/L

3脑缺血模型的制备麻醉大鼠分离组织结扎动脉插入栓线缝合创口恢复灌注给药方法

不给药缺血-再灌注后30分钟后给予2ml生理盐水灌胃一次，12h组大鼠在手术后8h再灌胃2ml生理盐水一次,24h、48h组大鼠按每日2次灌胃，最后一次灌胃在取标本前4h

以塞来昔布15mg/kg和25mg/kg剂量制成混悬液约2ml灌胃,灌胃时间和NS组相同LCIR组、HCIR组NS组S组脑缺血模型评分标准0分：无神经系统症状与体征1分：出现同侧Homer征，右侧前爪不能完全2分：行走时向右侧画圈(追尾现象)3分：站立时向右侧倾倒，不能行走或打滚4分:无自发活动，有意识障碍

1-3分为模型制备成功。

伸展标本的制备麻醉灌洗断头取脑以视交叉为中心、冠状位±1.5mm切取脑片甲醛固定制作石蜡切片成模大鼠检测免疫组化法检测各组大鼠缺血侧梗死灶周围皮质中NF-κB和COX-2的动态表达

每张切片梗死灶周围随机取5个视野,结果取平均数不同视野可分辨的NF-κBp65和COX-2阳性细胞百分率

光学显微镜NIKONHY100日本尼康统计方法

方差分析统计学方法所测数据采用x±s表示

α=0.05结

果表1各组神经功能缺损评分(x±s,n=5)时间NS组LCIR组HCIR组6h2.20±0.452.00±0.711.80±0.4512h2.40±0.902.20±0.842.00±0.7124h2.60±0.55▲1.60±0.551.40±0.89﹟48h2.40±0.55▲1.40±0.551.20±0.44﹟注：▲与LCIR组、HCIR组相同时间点比较P<0.05﹟与LCIR组相同时间点比较P<0.05COX-2的表达脑组织COX-2表达6h组24h组12h组48h组

分组6h12h24h48hS组15.2±2.1——————NS组35.7±3.3▲＃54.5±4.3▲＃49.7±2.4▲＃

43.9±3.0▲＃

HCIR组27.8±2.5▲★40.9±2.9▲★

36.3±2.2▲★

33.0±1.8▲★

LCIR组30.3±3.2▲44.0±2.3▲

39.0±2.4▲

34.7±3.3▲

表1各组大鼠不同时间点脑组织COX-2表达阳性率（%）

▲与同一组内其它亚组比较，p＜0.05﹟与S组、HCIR组、LCIR组中相同时间点比较及与比较，p＜0.05★与LCIR组中相同时间点比较，p＞0.05表1各组大鼠不同时间点脑组织COX-2表达阳性率（%）

NF-kB的表达LCIR组NF-KB免疫组化染色（×400）6h组12h组24h组48h组表1各组大鼠不同时间点脑组织NF-kB表达阳性率（%）

6h12h24h48hS组18.3±3.2——————NS组45.3±2.4▲＃

70.5±5.1▲＃

59.7±5.5▲＃52.4±5.6▲＃HCIR组33.0±3.1▲＃52.4±4.8▲＃

43.7±3.8▲＃38.4±3.2▲＃

LCIR组35.1±2.6▲56.4±4.7▲45.7±3.8▲

40.4±3.2▲

▲与同一组内其它亚组比较，p＜0.05﹟与S组、HCIR组、LCIR组中相同时间点比较及与比较，p＜0.05★与LCIR组中相同时间点比较，p＞0.05表1各组大鼠不同时间点脑组织NF-KB表达阳性率（%）

NF-kB和COX-2表达趋势图讨论COX-2炎症中所致细胞毒性其机制

反应产物前列腺素的增加，增强脑内兴奋性氨基酸的毒性作用和破坏性催化过程中生成的氧自由基的毒性作用加重脑缺血后的神经细胞的凋亡及增加NO的毒性效应本次试验本实验中发现COX-2在dIR组大鼠的各个时间点皆有表达，全脑均有散在表达，在梗死边缘形态尚正常和已经有形态改变的神经元中表达最强烈，缺血中心区也见表达，以12h表达