PCR技术原理与操作

PCR技术原理与操作主要内容核酸的种类与功能DNA复制原理PCR发展简史PCR基本原理PCR体系各组分及作用PCR操作步骤及分析PCR技术的优缺点脱氧核糖核酸核糖核酸核酸

核酸是细胞内携带遗传信息的物质，在生物体的遗传、变异和蛋白质的生物合成中起着极其重要的作用。１、种类２、功能简称DNA简称RNA一核酸的种类与功能3、微生物分类（按核酸类型）（1）DNA微生物：细菌、寄生虫类（附红细胞体、弓形体）、衣原体、支原体

DNA病毒

疱疹病毒科:伪狂犬病毒、马立克病毒、传染性喉气管炎病毒和鸭瘟病毒；圆环病毒科：猪圆环病毒、鸡传染性贫血病毒；

细小病毒科:猪细小病毒、犬细小病毒、番鸭细小病毒、鹅细小病毒；痘病毒科：鸡痘、山羊痘和绵羊痘；腺病毒科：减蛋综合征病毒和犬传染性肝炎病毒（2）RNA微生物RNA病毒

正粘病毒科：流感病毒

副粘病毒科：新城疫病毒、犬瘟热病毒、小反刍兽疫病毒

弹状病毒科：狂犬病病毒、牛流行热病毒冠状病毒科：鸡传染性支气管炎病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒、SARSV

黄病毒科：猪瘟、乙型脑炎病毒、牛病毒性腹泻病毒

小核糖核酸病毒科：口蹄疫病毒

披膜病毒科：猪繁殖与呼吸综合征病毒双RNA病毒：传染性法氏囊病毒反转录病毒：禽白血病、牛白血病、马传染性贫血病毒二DNA复制原理半保留复制1971年，Khorana提出：经过DNA变性，与合适引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆tRNA基因。但由于测序和引物合成的困难，以及70年代基因工程技术的发明使克隆基因成为可能，所以，Khorana的设想被人们遗忘了……三PCR发展简史KaryB.Mullis(1944-)，在Cetus公司工作期间，发明了PCR。他原本是要合成DNA引物来进行测序工作，却常为没有足够多的模板DNA而烦恼。1983年春夏之交的一个晚上，他开车去乡下别墅的路上萌发了用两个引物（而不是一个引物）去扩增模板DNA的想法…...三PCR发展简史Mullis开车的时候,瞬间感觉两排路灯就是DNA的两条链，自己的车和对面开来的车象是DNA聚合酶，面对面地合成着DNA，……1985年，美国PE-Cetus公司的Mullis等人发明了聚合酶链反应（PCR）基本原理是在试管中模拟细胞内的DNA复制最初采用E-coliDNA聚合酶进行PCR，由于该酶不耐热，使这一过程耗时，费力，且易出错耐热DNA聚合酶的应用使得PCR能高效率的进行，随后PE-Cetus公司推出了第一台PCR自动化热循环仪1993年，Mullis等因此项技术获诺贝尔化学奖三PCR发展简史四PCR基本原理类似于DNA的体内复制。首先待扩增DNA模板加热变性解链，随之将反应混合物冷却至某一温度，这一温度可使引物与它的靶序列发生退火，再将温度升高使退火引物在DNA聚合酶作用下得以延伸。这种热变性-复性-延伸的过程就是一个PCR循环，PCR就是在合适条件下的这种循环的不断重复。模板DNA95℃PCR原理PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点95℃50℃引物1引物2DNA引物PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点50℃引物1引物2DNA引物72℃Taq酶Taq酶PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点72℃第1轮结束95℃第2轮开始PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点95℃50℃72℃TaqTaqTaqTaqPCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点72℃第2轮结束PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点模板DNA第1轮扩增第2轮扩增第3轮扩增第4轮扩增第5轮扩增第6轮扩增1234522557294时间（min）温度（℃）适温延伸3高温变性1低温退火2重复1~3步25~30轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性DNA变性形成2条单链子链延伸DNA加倍四PCR基本原理1、PCR体系组分引物（primer）酶（TaqDNApolymerase）dNTP（dATP,dGTP,dCTP,dTTP）模板（template）Mg2+（magnesium）五PCR体系各组分及作用（1）模板

模板作为DNA合成时的初始链，可以是DNA或cDNA分子，模板需要量一般为102～105拷贝。（2）扩增缓冲液

缓冲液有助于酶的稳定，是给聚合酶提供一个最适合酶催化反应条件。10～50mmol/LTris-Hcl(pH8.3～8.8）（3）耐热DNA聚合酶

催化PCR反应，该酶是从Thermusaquaticus细菌中提取的特殊的耐热DNA聚合酶，可以耐受90℃以上的高温而不失活，不需要每个循环加酶，使PCR技术变得非常简捷、同时也大大降低了成本；具有5′→3′方向的聚合活性和外切活性。2、各要素作用五PCR体系各组分及作用美国Yellowstone公园的热泉嗜热水生细菌Thermusaquaticus1988年saiki从嗜热水生菌ThermusaquaticsYT-1株中直接分离出来。该菌株于1969年从美国黄石国家森林公园火山温泉中分离到。（4）4种dNTP混合物

四种脱氧核苷酸，是DNA的原料；dNTP的通常使用浓度为20～200μmol/L。

（5）引物作为合成起始的识别点，从引物末端开始延伸，合成整条链。通常使用浓度为0.1-0.5mol/L（6）Mg2+

Mg2+是DNA聚合酶的激活剂。Mg2+与dNTP以及DNA模板结合形成复合体，只有这种复合体才能被DNA聚合酶识别；通常使用浓度为0.5mmol/L-2.5mmol/L。五PCR体系各组分及作用六PCR操作步骤与结果分析1、RNA/DNA提取2、RNA的反转录3、PCR扩增4、电泳分析产物1、RNA/DNA提取（1）异硫氰酸胍法和Trizol提取法（RNA)（2）酚-氯仿提取法和DNAzol提取法（DNA)（3）柱子提取法（4）全自动核酸提取法（1）Trizol提取RNA法：取1.5mL灭菌Eppendorf管，每管加入300µL裂解液，然后分别加入待测样品、阴阳性对照各100µL，吸头反复吸打混匀（一份样品换用一个吸头）室温放置2-5min；再加入100µL氯仿，充分颠倒混匀（不宜过于强烈）；于4℃条件下，12000r/min离心15min。Trizol使细胞结构降解，核蛋白迅速与核酸分离。加入氯仿，有变性蛋白质的作用，主要用处是用来分相，加速有机相和水相的分层。吸取离心后各管中的上清液150µL转移至新的1.5mL灭菌Eppendorf管中（注意不要吸出中间层，要缓慢出），加入150µL－20℃预冷的异丙醇，颠倒混匀，室温放置15min。异丙醇沉淀，优点是容积小且速度快，主要沉淀核酸。（1）Trizol提取RNA法：4℃条件下12000r/min离心15min（Eppendorf管开口保持朝离心机转轴方向放置）。轻轻倒去上清，倒置于吸水纸上，吸干液体，不同样品应置于吸水纸不同地方沾干。加入1mL75%乙醇，轻轻颠倒洗涤。4℃条件下12000r/min离心5min（Eppendorf管开口保持朝离心机转轴方向放置）。轻轻倒去上清液，倒置于吸水纸上，沾干液体，不同样品应在吸水纸不同地方沾干。乙醇主要是洗涤异丙醇，也可以溶解一部分蛋白。(1)Trizol提取RNA法：4℃条件下12000r/min离心30s，将管壁上的残余液体甩到管底部，用微量加样器尽量将其吸干，一份样本换用一个吸头（注意：滴头勿接触沉淀），真空抽干3-5min或室温干燥10min。不宜过于干燥，以免RNA不溶。加入11µLDEPC水，轻轻吹打混匀，溶解管壁上的RNA，2000r/min离心5s，冰上保存备用。提取的RNA须在2h内进行RT-PCR扩增或放置于－70℃冰箱备用。注意事项RNA提取时，要戴口罩、手套，所用EP管、滴头及相关容器等要清洁，用0.1%DEPC水处理12h以上再经高压处理,烘干后方可使用。要有专用操作台（在超净工作台或生物安全柜进行操作）。所有试剂应在规定的温度储存，使用后立即放回。异丙醇和75%乙醇要放在－20℃预冷。加样和混匀时一份样品要换用一个吸头，不同样品加同一试剂时吸头要悬空加入，避免交叉污染。加入Trizol试剂后要作用一定时间（5min），使其充分裂解释放RNA。吸取水相RNA时，要避免吸到中间液面（蛋白质层），从而保证RNA纯度。要小心、细致、晃动及每次移液要轻。这样做的目的：一是小心RNase的污染降解RNA；二是动作过大会破坏RNA的完整性。要勤换手套，操作过程速度要快。

(2)DNA提取样品采集：取病死或扑杀的动物组织；活体动物可取血清、咽喉或鼻腔拭子。样品处理：每份样品分别处理①组织样品处理：称取待检病料0.2g置组织研磨器中剪碎并研磨，加入600µL裂解液继续研磨。取已研磨好的待检病料离心后取上清100µL加入1.5mL灭菌离心管中，再加入500µL裂解液和10µL蛋白酶K，混匀后，置55℃水