乳腺癌基因治疗研究进展课件

乳腺癌基因治疗研究进展Theresearchprogressofhumanbreastcancergenetherapy分子生物学系乳腺癌基因治疗研究进展12

乳腺癌是严重危害妇女健康的恶性肿瘤。据国际抗癌协会（IARC）公布的统计资料表明，乳腺癌在全世界大多数地区的发病率有逐年增高的趋势，现已成为女性发病率最高的恶性肿瘤。

第一节

乳腺癌基因治疗研究背景2乳腺癌是严重危害妇女健康的恶性肿瘤。据国际抗癌协会（23乳腺癌的危险因素：(1)与发育、激素水平有关(2)与营养膳食有关(3)与家族史和基因改变遗传因素有关

a.抑癌基因失活

b.癌基因异常(4)其它危险因素3乳腺癌的危险因素：34乳腺癌肿瘤治疗模式

手术、放疗、化疗、激素治疗是肿瘤治疗的常规模式。这些治疗方法常难彻底消灭肿瘤细胞又易伤及正常组织，特别是伤害机体的免疫系统。目前肿瘤的基因治疗日益受到人们的重视，显示出良好的应用前景。4乳腺癌肿瘤治疗模式手术、放疗、化疗、激素治疗是肿瘤治45乳腺癌发病的分子机理主要有两个方面：第一、基因表达异常。

最常见的基因表达异常是cyclinD1、neu和ras、c-myc或Wnt-1原癌基因过表达。第二、基因结构改变。包括染色体缺失与基因扩增。

第二节乳腺癌自杀基因治疗的概念、内容与特点5乳腺癌发病的分子机理主要有两个方面：第二节乳腺癌自杀基因56Breastcancergenetherapyusingtumoursuppressorgenes

Clinicaltrialsofp53genereplacementhavehadlimitedsuccess;PTEN

expressionaltersmetastaticpotentialandreducesneovascularization6Breastcancergenetherapyus67Prospects

TheabilitytoinducegrowtharrestandapoptosisDownstreamtargetsofp53andRbisnecessaryClinicaltrialsofsecond-generationoncolyticvirusesCombinationsoftumoursuppressorgenes7ProspectsTheabilitytoindu78乳腺癌抗体治疗

单克隆抗体Herceptin(贺赛汀)

针对HER-2/neu原癌基因的人/鼠嵌合单抗，与细胞表面的erb-B2受体结合,抑制乳腺癌细胞的生长,产生抗体依赖细胞介导的细胞毒作用。8乳腺癌抗体治疗单克隆抗体Herceptin(贺赛汀)8免疫基因治疗指在基因水平，通过诱发或加强机体内针对肿瘤细胞表面的肿瘤相关抗原（TAAs）的特异性免疫反应，调动宿主的免疫系统来识别并破坏癌细胞。乳腺癌组织表达多种TAAs，包括HER-2/neu（c-er-2）、MACG-1和MUC-1等，机体针对这些TAAs产生一定的特异性体液和细胞免疫反应。免疫基因治疗指在基因水平，通过诱发或加强机体内针对肿瘤细胞表9

将编码促进免疫反应的细胞因子的基因直接在体内转染到肿瘤细胞内，或在体外将这些基因转染到肿瘤细胞内，在肿瘤细胞经放射线照射灭活后，自身移植于体内，以增强免疫反应。包括IL-2、IL-12、干扰素、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）等。10将编码促进免疫反应的细胞因子的基因直接在体内转染到肿瘤细10采用特异的靶抗原作为疫苗对肿瘤的免疫反应更有效。目前用于乳腺癌免疫治疗的特异抗原包括HER-2、CEA、MAGE-1、MUC-1等。采用基因工程将编码这些抗原的基因修饰后，克隆到逆病毒载体，转入体内；或在体外采用基因工程，将这些抗原的不同抗原簇克隆，产生不同抗体，筛选出能抑制肿瘤细胞生长的抗体。赫赛汀（Herceptin）就是针对c-er-2细胞外区域不同抗原簇的人单克隆抗体。它可有效抑制c-er-2的下游信号传导，从而抑制乳腺癌细胞的生长。特异性靶抗原的免疫治疗采用特异的靶抗原作为疫苗对肿瘤的免疫反应更有效。目前用于11肿瘤抑癌基因治疗

野生型p53基因具有通过调控视网膜母细胞瘤基因控制细胞凋亡、抑制细胞增殖的作用。但是，由于乳腺癌细胞中p53易突变而失活，影响了p53基因治疗乳腺癌应用。在乳腺癌家族中发现抑癌基因BRCA1常存在突变而表达过低。在乳腺癌动物模型中采用装有BRCA1的逆病毒载体，直接注射入瘤内，可抑制晚期乳腺癌胸壁转移瘤的生长。肿瘤抑癌基因治疗

野生型p53基因具有通过调控视网膜母细胞12化学基因治疗将耐药基因，如多药耐药基因（MDR）转入造血干细胞，然后自体回输以增加化疗药物剂量，增强疗效，也不影响机体的造血系统。Cowan等将4例乳腺癌病人的造血细胞提取后，体外转染MDR基因，并且在体外应用大剂量化学药物杀死可能污染的肿瘤细胞后，将转染了MDR的造血细胞自身移植。给予大剂量的化学药物治疗后，3例病人移植细胞中仍可检测到MDR的表达，转染MDR的细胞存活率与骨髓抑制成反比，无严重毒副作用发生。化学基因治疗将耐药基因，如多药耐药基因（MDR）转入造血干13药物前体激活基因治疗（GPAT）可以利用正常和肿瘤细胞之间的某一基因转录差异，选择性驱动表达导入肿瘤细胞内的无活性化疗药物前体转化为有活性的代谢产物，特异性杀伤肿瘤细胞。氟脲类药物对乳腺癌有杀伤作用，但5-氟胞嘧啶核苷酸（5-FC）作为药物前体，对细胞无杀伤作用，而它在嘧啶脱氨酶的转化下，可代谢为有活性的5-FU（5-氟尿嘧啶）而具有杀伤肿瘤细胞的能力。药物前体激活基因治疗（GPAT）可以利用正常和肿瘤细胞之间的14化合物中筛选出一种名为维生素B17的化合物。维生素B17可以通过竞争性结合ATP，不可逆地抑制c-er-2活性，而不影响其蛋白表达。动物实验表明，维生素B17可使c-er-2过度表达的乳腺癌肿瘤缩小。化合物中筛选出一种名为维生素B17的化合物。维生素B17可以15显性基因敲除治疗敲除显性的癌基因，削弱肿瘤的生长和浸润能力。研究表明，一种myc反义核酸对雌激素依赖型和非依赖型乳腺癌细胞均有抑制作用，转化生长因子α（TNF-α）的反义信使RNA能够抑制雌激素诱导的雌激素反应性乳腺癌细胞的增殖。显性基因敲除治疗敲除显性的癌基因，削弱肿瘤的生长和浸润能力。16抗血管生成基因治疗抗血管生成基因的因子包括内皮抑素、血管抑素和干扰素-α。基于肿瘤和正常内皮细胞之间基因表达的差异，选择性抑制肿瘤内皮细胞中异常基因的表达，抑制肿瘤血管生成，从而达到治疗肿瘤的目的。最强的血管生成细胞因子是VEGF。反义核酸，可溶性VEGFR、核糖酶、抗VECF单克隆抗体和受体酪氨酸激酶（RTK）抑制剂已被用于抗肿瘤血管生成的基因治疗。抗血管生成基因治疗抗血管生成基因的因子包括内皮抑素、血管抑素1718自杀基因治疗乳腺癌的作用机理病毒载体病毒蛋白自杀基因药物前体

毒性代谢物乳腺癌细胞直接杀伤癌细胞通过旁观者效应杀伤癌细胞18自杀基因治疗乳腺癌的作用机理病毒载体病毒蛋白自杀基因药物1819

自杀基因HSVtk编码胸腺嘧啶激酶，在细胞内，自杀基因HSVtk能将核苷类似物GCV磷酸化，使其进一步代谢为三磷酸GCV，抑制细胞DNA聚合酶，影响DNA合成，导致细胞死亡，达到清除肿瘤的目的。19自杀基因HSVtk编码胸腺嘧啶激酶，在细胞内，1920

存在的问题

？

目的基因的表达不受控制，存在过度表达或不适当表达，特别是当插入基因是一些毒性的基因或对机体有影响时，不仅对疾病的治疗不利，甚至会导致致命的副作用。20存在的问题？目的基因的表达不受控制，存在过度2021

特异性的转录调控元件使治疗基因准确、有效地表达于肿瘤细胞，使治疗基因的表达受体外因素的调控，提高基因治疗的有效性和可控性，是基因治疗领域的一个重要问题。

第三节

乳腺癌自杀基因调控治疗21特异性的转录调控元件使治疗基因准确、有效地表达于2122乳腺癌基因治疗的调控元件1)乳腺癌相关基因：erbB-2、Muc-1、p53、BRCA1、BRCA2、nm23、p16等；

2)组织特异性基因:雌激素反应元件(ERE)、人α乳白蛋白基因(hALA)、羊乳球蛋白基因(oBLG)等；3)缺氧反应元件(HRE)等。

22乳腺癌基因治疗的调控元件1)乳腺癌相关基因：erbB-22223Tet基因表达调控系统

Tet系统利用大肠杆菌抗四环素操纵子的阻遏与去阻遏作用来调控基因表达，使基因表达受四环素的精确调控。Tet激活系统（Tet-On）是突变的tet阻遏蛋白与VP16的激活域融合表达rtTA,强力霉素存在时，rtTA与tetOp结合，激活靶向转录。

23Tet基因表达调控系统Tet系统利用大肠杆菌2324

Tet-On调节乳腺癌细胞株HSVtk表达及体外调控性治疗作用的实验研究24Tet-On调节乳腺癌细胞株HSVtk表达及2425

重组逆转录病毒载体pRevTRE/tk的构建

PCR扩增获得HSVtk基因DNA片段，设计引物时，在引物TK1的5’加上BamHⅠ酶切位点，引物TK2的5’加上Hind

Ⅲ

酶切位点，定向克隆到pRevTRE质粒上,得到pRevTRE/tk质粒。25重组逆转录病毒载体pRevTRE/tk的构建2526重组逆转录病毒载体pRevTRE/tk的鉴定M12图1

重组质粒pRevTRE/tk的酶切鉴定结果M:λDNA/HindⅢDNAMarkerlane1:pRevTRE/HSVtk/Bam

HI+HindⅢ;lane2:pRevTRE/HSVtkplasmidDNA图2重组质粒pRevTRE/tk

的PCR鉴定结果M:100bpDNAladderMarker;lane1:PCRproductwithprimerTK1andTK2;lane2:PCRproductwithprimerTK3andTK426重组逆转录病毒载体pRevTRE/tk的鉴定M2627

MCF-7细胞转染实验

MCF/TRE/tk/Tet-On27MCF-7细胞转染实验MCF/TRE/tk/Tet-2728Tet-On基因调控系统中，其发挥作用所需的两个组成元件：TRE元件和rtTA元件，分别克隆于两个载体系统中。使用时先将含有TRE元件和目的基因转染入宿主细胞，然后再以含有rtTA的质粒转染该细胞，经过两次转染而构建出细胞株。28Tet-On基因调控系统中，其发挥作用所需的两个组成2829MCF/TRE/tk/Tet-On细胞HSVtk基因的表达

图3Dox调节MCF/TRE/tk/Tet-On细胞中HSVtk基因的表达

M:100bpDNAMarker;Lane1-6代表Dox浓度为0，0.1，1，10，100,1000μg/ml时细胞HSVtk基因的表达29MCF/TRE/tk/Tet-On细胞HSVtk基2930MTT法检测分析MCF/TRE/tk/Tet-On细胞存活率

图4在Dox浓度为1μg/ml时，MTT法检测GCV不同浓度时MCF/TRE/tk/Tet-On细胞存活率的变化30MTT法检测分析MCF/TRE/tk/Tet-On3031Dox浓度对MCF/TRE/tk/Tet-On细胞生长的影响

图5GCV浓度为1μg/ml时，不同浓度Dox对MCF/TRE/tk/Tet-On细胞存活数的影响31Dox浓度对MCF/TRE/tk/Tet-On细胞3132旁观者效应

表1MCF/TRE/tk/Tet-On细胞旁观者效应的克隆记数1组(n=4)2组(n=4)3组(n=4)4组(n=4)5组(n=4)6组(n=4)MCF-7100%95%90%75%50%0%MCF/TRE/tk/Tet-On0%5%10%25%50%100%克隆计数(均值±SE)36.0±0.8134.0±0.814.5±0.655.0±0.715.0±0.583.5±0.5032旁观者效应表1MCF/TRE/tk/Tet-O3233可调控性自杀基因乳腺癌动物模型的建立

以表达HSVtk基因及调控系统Tet-On的乳腺癌细胞MCF/TRE/tk/Tet-On直接接种SCID小鼠成功建立了可调控性自杀基因乳腺癌动物模型，为探讨自杀基因体外调控机制的研究奠定了基础。33可调控性自杀基因乳腺癌动物模型的建立以表达HSV3334SCID小鼠体内成瘤及治疗前后肿瘤大小的变化

图6乳腺癌细胞MCF/TRE/tk/Tet-On接种SCID小鼠后，NS组、GCV组、GCV+Dox组SCID小鼠肿瘤体积的变化34SCID小鼠体内成瘤及治疗前后肿瘤大小的变化图63435SCID小鼠肿瘤组织病理学观察

图7三组（NS组、GCV组、GCV+Dox组）SCID乳腺癌小鼠经治疗15天后肿瘤组织病理学观察H-E染色（×250）

NS对照组;GCV治疗组;Dox+GCV治疗组35SCID小鼠肿瘤组织病理学观察图7三组（NS组3536RT-PCR检测SCID小鼠肿瘤组织HSVtk的表达

M123图8RT-PCR检测各组SCID小鼠肿瘤治疗15天后HSVtk的表达M:100bpMarker;1.GCV治疗组;2.Dox+GCV治疗组;3.NS对照组36RT-PCR检测SCID小鼠肿瘤组织HSVtk的表3637研究背景

逆转录病毒载体用于exvivo基因治疗，实际感染效率低。原因:一、感染正在分裂的细胞；二、获得病毒滴度低；三、病毒半衰期短，移动距离有限,在一个半衰期内大多数病毒不能到达靶细胞。重组逆转录病毒介导的HSVtk基因表达及提高逆病毒滴度的初步研究37研究背景逆转录病毒载体用于exvivo基因治疗3738逆转录病毒的纯化

将初步浓缩的病毒液经冷冻干燥去除更多的水分，以小体积的缓冲液（DMEM）复溶后－70℃冻存得到浓缩病毒液。38逆转录病毒的纯化将初步浓缩的病毒液经冷冻干燥去除更多的3839产毒PA317阳性细胞克隆筛选培养

图14微乒乓感染pRevTRE/HSVtk、pRevTet-On、pRevTRE

载体的PA317细胞经潮霉素B、G418筛选2周后形成的抗性克隆(×100)

39产毒PA317阳性细胞克隆筛选培养3940不同培养时间与重组病毒滴度的关系

图9

不同培养时间对克隆PA317细胞产生重组病毒滴度的测定40不同培养时间与重组病毒滴度的关系图9不同培养时间4041不同丁酸钠浓度和重组病毒滴度的关系

05101520图10

不同丁酸钠浓度下对克隆PA317细胞培养30h

产生重组病毒滴度的测定41不同丁酸钠浓度和重组病毒滴度的关系4142SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测有无病毒蛋白表达

图11

克隆PA317细胞上清SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳M：蛋白质分子标准；Lane1：pRevTREDNA转染PA31730h后细胞上清；Lane2：pRevTRE/tkDNA转染PA31730h后细胞上清42SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测有无病毒蛋白表达图114243PCR检测克隆的细胞上清有无HSVtk基因插入片段

1,240bp图12转染PA317细胞上清PCR扩增HSVtk基因M：100bpDNA标准物；Lane1：pRevTRE/tkDNA转染PA31730h后细胞上清；Lane2：pRevTREDNA转染PA31730h后细胞上清

43PCR检测克隆的细胞上清有无HSVtk基因插入片段4344RT-PCR检测被逆转录病毒浓缩液感染的MCF-7细胞中HSVtk基因的表达

β-actin420bp图13逆转录病毒浓缩液感染的MCF-7细胞中HSVtk基因的表达M：100bpDNA标准物；Lane1：MCF-7细胞；Lane2：被重组逆转录病毒液感染的MCF-7细胞44RT-PCR检测被逆转录病毒浓缩液感染的MCF-74445产毒性细胞系分泌重组病毒的PCR鉴定图15pRevTRE/tk、pRevTet-On、pRevTRE乒乓转染的PA317细胞上清PCR扩增目的基因M：100bpladdermarker；1：转染pRevTRE/HSVtk质粒载体的克隆PA317细胞上清；2：转染pRevTet-On质粒载体的克隆

PA317细胞上清；3：转染pRevTRE质粒载体的克PA317

细胞上清45产毒性细胞系分泌重组病毒的PCR鉴定图154546重组病毒感染MCF-7细胞及阳性克隆细胞株的筛选

图16重组病毒感染MCF-7细胞后筛选的潮霉素B和G418抗性克隆(×100)

可调控性重组逆转录病毒在乳腺癌基因治疗中的实验研究46重组病毒感染MCF-7细胞及阳性克隆细胞株的筛选图4647

制备重组逆转录病毒RevTRE/HSVtk和RevTet-On，然后通过逆转录病毒感染靶细胞，将Tet-On基因调控系统中的反应元件TRE和rtTA调控元件共同整合到同一宿主细胞中，使目的基因导入靶细胞，并处于Tet-On基因的有效调控，同时也提高了外源目的基因的转导效率。

47制备重组逆转录病毒RevTRE/HSVtk和R4748病毒感染细胞基因组DNA的提取与酶切

图17病毒感染细胞基因组DNA的提取与酶切图M：LambdaDNA/EcoRI+HindⅢDNAMarker；1：逆病毒RevTRE/HSVtk和RevTet-On感染MCF-7细胞基因组

DNA；2：MCF-7细胞基因组DNA；3：MCF-7细胞基因组DNAEcoRI酶切；4：逆病毒RevTRE/HSVtk、RevTet-On感染MCF-7细胞基因组

DNAEcoRI酶切48病毒感染细胞基因组DNA的提取与酶切图174849逆病毒感染细胞Southern印迹杂交分析

M123

图18细胞Southern印迹杂交分析图

M：100bpladdermarker；

1：MCF-7细胞；

2：逆病毒RevTRE/HSVtk、RevTet-On一次感染的MCF-7细胞；

3：逆病毒RevTRE/HSVtk、RevTet-On重复感染的MCF-7细胞49逆病毒感染细胞Southern印迹杂交分析4950利用微乒乓感染的方法将制备的重组逆转录病毒RevTRE/HSVtk和RevTet-On导入乳腺癌细胞株MCF-7细胞。实验中观察到，HSVtk基因的表达受Dox的诱导调控，随着Dox的浓度增高，GCV对乳腺癌细胞的杀伤能力加强。

50利用微乒乓感染的方法将制备的重组逆转录病毒RevTRE5051台盼蓝排斥试验和细胞计数分析检测细胞活力图19不同Dox浓度诱导下台盼蓝排斥试验和细胞计数51台盼蓝排斥试验和细胞计数分析检测细胞活力图19不同5152MTT法检测重组病毒感染的MCF-7细胞不同药物浓度诱导24h的存活率n=4n=452MTT法检测重组病毒感染的MCF-7细胞不同药物浓5253流式细胞分析图20流式细胞仪（FCM）检测细胞凋亡图1：MCF-7细胞；2：逆病毒RevTRE/HSVtk、RevTet-On感染的MCF-7细胞；3：1μg/mlDox、2μg/mlGCV作用48h的逆转录病毒感染

MCF-7细胞53流式细胞分析图20流式细胞仪（FCM）检5354流式细胞仪（FCM）检测细胞周期

图21流式细胞仪（FCM）检测细胞周期图

1：MCF-7细胞；

2：逆病毒RevTRE/HSVtk、RevTet-On感染的MCF-7细胞；

3：1μg/mlDox、2μg/mlGCV作用48h的逆转录病毒感染MCF-7细胞

54流式细胞仪（FCM）检测细胞周期图21流式5455半定量RT-PCR的方法探讨重组逆转录病毒感染MCF-7细胞在Dox不同浓度诱导下自杀基因的表达

55半定量RT-PCR的方法探讨重组逆转录病毒感染MCF5556TUNEL分析图22TU