菠萝蛋白酶的酶促进作用研究

菠萝蛋白酶的酶促进作用研究

酶在人们的活动和工业应用中起着非常重要的作用。金属是食品加工中不可避免的接触。通过研究金属离子对酶的具体作用情况,可以掌握食品加工中和工业酶的应用过程中对金属离子浓度等的控制,以利用其对酶的激活作用并且避免其对酶的抑制失活作用,使酶达到更大程度的应用。本试验主要研究金属离子与菠萝蛋白酶反应后,对菠萝蛋白酶活性及热稳定性的影响。1材料和方法1.1siga公司的纺粘设备菠萝蛋白酶(Bromelain)、酪蛋白:美国Sigma公司;L-酪氨酸,三氯乙酸,无水醋酸钠,冰醋酸,36%盐酸,氢氧化钠,氯化钙,氯化镁,氯化锌,氯化锰等,以上试剂均为分析纯。1.2测试方法1.2.1酶活性的测定在酶液中分别准确加入不同浓度的金属离子溶液,加入比例为1∶1,摇匀后取混合液1mL,按照F.I.T法测定酶活性。金属离子浓度梯度为(1~15mmol/L,温度(37±0.5)℃,反应时间10min,测定波长275nm。1.2.2所含肽的数量测定测定原理:菠萝蛋白酶将酪蛋白分解,生成在三氯乙酸溶液中不沉淀的多肽,并在275nm处有吸收峰,除去未被消化的酪蛋白,用分光光度计(275nm测定溶液中所含肽的数量。蛋白酶活力单位的定义为:在一定温度和pH值条件下,lmin水解酪蛋白产生lμg酪氨酸为l个酶活力单位,以U/g(U/mL)表示。1.2.3环保酶的活性测定将酶溶液与最适合(最差)条件下络合的金属离子-酶络合溶液置于60~80℃下,分别处理不同时间后(0~200min),用紫外光谱法测定溶液残留的酶活。菠萝蛋白酶热失活遵循动力学—级反应规律。温度恒定时,若酶的热失活是动力学一级反应,即EacitveKbEinactive,根据动力学理论,则有式中[E]为活性酶浓度,Kd为热失活常数。将公式(1)转化为积分形式:式中[E0]为酶的初始浓度。以ln([E]/[E0])对t作图得一过原点直线,斜率为Kd,从公式(2)求得酶的热失活半衰期t1/2=ln2/Kd。2结果与讨论2.1z2c+直接加入对菠萝蛋白酶活性的影响由图1可知,Mg2+对菠萝蛋白酶酶活性作用随着浓度呈现抛物线变化,当Mg2+浓度小于4mmol/L时,Mg2+对菠萝蛋白酶酶活性有促进作用,且浓度为4mmol/L促进作用最明显,菠萝蛋白酶酶活升高4.15%。Ca2+对菠萝蛋白酶的酶活性随着浓度的变化有不同的作用,其中Ca2+浓度为2mmol/L时对酶活性促进作用最明显,比原酶活性高出约6%,而低浓度(1mmol/L)和高浓度(5mmol/L)的Ca2+对菠萝蛋白酶的活性却有抑制作用,使菠萝蛋白酶的活性分别降低0.2%和2.4%。不同浓度的Mn2+直接加入反应体系后,菠萝蛋白酶的活性均得到促进且抑制效果不同,浓度为2mmol/L时对酶活性促进作用最明显,酶活性升高了7.17%。Zn2+对菠萝蛋白酶的活性抑制作用明显,且随浓度的增大抑制作用越大。吴京平通过金属离子对蛋白酶活力和热稳定性的影响,发现钙、镁、锰这三种金属离子对1398中性蛋白酶都有促进作用,但促进作用的大小及其随浓度的变化规律等不尽相同。2.2不同浓度ca2+对菠萝蛋白酶酶稳定性的影响由图2和图3可知,Ca2+与菠萝蛋白酶在不同温度下处理10min后,除了Ca2+浓度为1mmol/L时其在高温下对菠萝蛋白酶基本没有稳定作用外,其他浓度的Ca2+处理菠萝蛋白酶后,酶在高温作用下的保存率较高,说明Ca2+对菠萝蛋白酶具有稳定作用。尤其是当Ca2+浓度为5mmol/L时,在80℃下处理10min后的菠萝蛋白酶酶活性仍保留84.79%,比纯酶活性高出约17%。当Mg2+浓度为1mmol/L时,在80℃下处理10min后的菠萝蛋白酶酶活比纯酶活性高出约7%。Mn2+除了浓度为2mmol/L时其在高温下对菠萝蛋白酶具有稳定作用外,其他浓度的Mn2+均使菠萝蛋白酶的稳定性都降低。Zn2+随着浓度的增加,使菠萝蛋白酶稳定性越差。研究还发现,不管金属离子浓度如何,菠萝蛋白酶在90℃以上的温度环境中处理10min后菠萝蛋白酶均基本失去活性。2.3m2+添加合成酶后的菠萝专利酶稳定效果由图4可知,Ca2+的加入对菠萝蛋白酶的热稳定性产生了一定的影响,最具特点的是,在前20min,所有浓度的Ca2+处理菠萝蛋白酶后,其活性都比无处理下的菠萝蛋白酶活性下降得快。但Ca2+对菠萝蛋白酶的稳定作用在20min后显示出来,这与前面对Ca2+与酶作用时间对酶活性的影响的结论一致。其中,以浓度为3mmol/L时Ca2+的稳定效果最好,在60℃中保温100min后,酶活保留率能够达到67.96%,而原酶残留41.62%。Mg2+的加入对菠萝蛋白酶的热稳定性并没有明显的促进影响。只有Mg2+浓度为4mmol/L时其对菠萝蛋白酶在高温下具有稳定作用,在60℃中保温100min后,酶活保留率能够达到32.4%,而原酶残留30.5%。Mn2+的加入对菠萝蛋白酶的热稳定性效果一般,但比起原酶热稳定性有所提高,这种提高作用随着Mn2+浓度的增加降低。Zn2+对菠萝蛋白酶的热稳定性有抑制作用,且随着Zn2+浓度的增加,这种抑制作用越明显。2.46菠萝蛋白酶的活性测定图5至图8是根据不同试验环境,平行比较金属离子对菠萝蛋白酶半衰期的影响。由图5可知菠萝蛋白酶在60℃下活性的半衰期为92.42min,除Ca2+浓度为1mmol/L外,其他浓度Ca2+与菠萝蛋白酶作用后,酶的半衰期均有所延长,效果最明显的是Ca2+浓度为3mmol/L,菠萝蛋白酶的半衰期延长了55min,增加了原菠萝蛋白酶的59.5%。当浓度大于3mmol/L后,菠萝蛋白酶的半衰期下降,但仍然比原菠萝蛋白酶半衰期时间长。由图6至图8可知菠萝蛋白酶在60℃下活性的半衰期为67.96min,Mg2+浓度为4mmol/L时半衰期延长了13.6min,增加了原菠萝蛋白酶的20%。Mn2+浓度为1mmol/L时时半衰期延长了19.78min,增加了原菠萝蛋白酶的29%。Zn2+浓度为1mmol/L时时半衰期延长了5.78min,增加了原菠萝蛋白酶的8.5%。由半衰期比较可知,这四种金属离子中Ca2+对菠萝蛋白酶的热稳定性作用效果最好,而Zn2+作用效果最差。3种金属离子对菠萝蛋白酶热稳定性的影响本试验研究表明,Mg2+、Mn2+和Ca2+对菠萝蛋白酶的酶活性均有促进作用,且在浓度分别为4mmolL,2mmol/L和2mmol/L最明显,此时菠萝蛋白酶的酶活性比原酶活性分别高出4.15%、7.17%、6%;Zn2+对菠萝蛋白酶的活性抑制作用明显,且随浓度的增大抑制作用越大。在60℃下Ca2+、Mn2+对菠萝蛋白酶的热稳定性具有促进作用,Ca2+浓度为3mmol/L,菠萝蛋白酶的半衰期延长了55min,增加了原菠萝蛋白酶的59.5%。Mn2+浓度为1mmol/L时半衰期延长了19.78min,比原菠萝蛋白酶的增加了29%。Mg2+、Zn2+对菠萝蛋白酶的热稳定性没有明显的促进作用,Mg2+浓度为4mmolL时半衰期延长了13.6