冰冻切片与石蜡切片的区别之欧阳美创编

欧阳美创编 欧阳美创编 2021.01.01 欧阳美创编 2021.01.01欧阳美创编 欧阳美创编 2021.01.01 欧阳美创编 2021.01.011.冰冻切片是免疫组织化学染色中最常用的一种切片方法。其最突出的优点是能够较完好地保存多种抗原的免疫活性，尤其是细胞表面抗原更应采用冰冻切片。新鲜的组织及已固定的组织均可作冰冻切片。时间：2021.01.01创作^欧阳美冰冻时，组织中水份易形成冰晶，往往影响抗原定位。一般认为冰晶少而大时，影响较小，冰晶小而多时，对组织结构损害较大，在含水量较多的组织中上述现象更易发生。冰晶的大小与其生长速率成正比，而与成核率(形成速率)成反比，即冰晶形成的数量愈多则愈小，对组织结构影响愈严重。因此，应尽量降低冰晶的数量。Fish认为冰冻开始时，冰晶成核率较慢，以后逐渐增加，其临界温度为-33。C,从-30。C降至-43。C之间，成核率急剧增加达1018,然后再减慢。基于上述理论可采取以下措施减少冰晶的形成。(1)速冻，使组织温度骤降，缩短从-33。C43OC的时间,减少冰晶的形成。其方法有二：干冰-丙酮（酒精）法:将150-200nil丙酮（酒精）装入小保温杯内，逐渐加入干冰，直至饱和呈粘稠状，再加干冰不再昌泡时，温度可达-70°CC,用一小烧杯（50-100inl）内装异戊烷约50ml,再将烧杯缓慢置入干冰丙酮（纯酒精）饱和液内，至异戊烷温度达-709时即可使用。将组织（大小为lcmXO.8cmX0.5cm）投入异戊烷内速冻30-60s后取出，或置恒冷箱内以备切片，或置-8（rc低温冰箱内贮存。液氮法：将组织块平放于软塑瓶盖或特制小盒内（直径约2cm）,如组织块小可适量加OCT包埋剂浸没组织，然后将特制小盒缓缓平放入盛有液氮的小杯内，当盒底部接触液氮时即开始气化沸腾，此时小盒保持原位切勿浸入液氮中，大约10-20s组织即迅速冰结成块。取出组织冰块立即置入-8（TC冰箱贮存备用，或置入恒冷箱切片机冰冻切片。（2）将组织置于20%-30%蔗糖溶液1〜3天，利用高渗吸收组织中水分，减少组织含水量。影响冰冻切片的因素较多，因此，技术难度较大，选择好的冰冻切片机是保证切片质量的关键。目前冰冻切片机有两类：①恒慢冰冻切片机（Cryastat）：为较理想的冰冻切片机，型号很多，但其基本结构是将切片机置于-30°CC低温密闭室内,故切片时不受外界温度和环境影响，可连续切薄片至2-4ym,完全能满足免疫组织化学标记要求。切片时，低温室内温度以-15°C~18°C为宜，温度过低组织易破碎，抗卷板的位置及角度要适当，载玻片附贴组织切片，切勿上下移动。②开放式冰冻切片机：包括半导体致冷切片机和甲醇致冷切片以及老式的C02、氯乙烷等冷冻切片机。切片时暴露空气中，温度不易控制，切片技术难度大，在高温季节，切片更加困难,且切片厚8〜15um,不易连续切片，但其优点是价廉，国内有生产。冰冻切片后如不染色，必须吹干，贮存低温冰箱内，或进行短暂预固定后贮存冰箱保存。2.石蜡切片其优点是组织结构保存良好，在病理和回顾性研究中有较大的实用价值，能切连续薄片，组织结构清晰，抗原定位准确。用于免疫组化技术的石蜡切片制备与常规制片略有不同：①脱水、透明等过程应在4£。C下进行，以尽量减少组织抗原的损失。②组织块大小应限于2cmX1.5cmX0.2cm,使组织充分脱水、透明、浸蜡。③浸蜡、包埋过程中，石蜡应保持在6（TC以下，以溶点低的软蜡最好（即低温石蜡包埋）。组织块脱水、透明、浸蜡时间参考表1-3：表1-3组织块处理时间表70%乙醇4°C3〜4h80%乙醇4°C3〜4h90%乙醇4°C2〜3h95%乙醇I4°C2〜3h95%乙醇II4°C1〜2h100%乙醇I4°C1.5h100%乙醇II4°C1.5h二甲苯I4°C0.5〜lh二甲苯II4°C0.51〜lh石蜡I60°Clh石蜡II60°C2h以上全过程为18-24h,也可在室温内使用自动脱水机代替。如组织块小，直径小于0.5cm,可用快速石蜡包埋切片，全过程只需4h左右。石蜡切片为常规制片技术，切片机多为轮转式，切片厚度2〜7urn,应用范围广，不影响抗体的穿透性，染色均匀一致。由于甲醛固定、有机熔剂和包埋剂对组抗原有一定的损害及遮蔽，使抗原特征发生改变。有人报告经蛋白酶消化，可以改善光镜免疫组化染色强度，常用的有胰蛋白酶、链霉蛋白酶及胃蛋白酶等消化法。石蜡切片应入37*恒温箱过夜，这样烤片可减少染色中脱片现象。切片如需长期贮存，可存放于QC冰箱内备用。石蜡切片优点较多，但在制片过程中要经过酒精、二甲苯等有机溶剂处理，组织内抗原活性失去较多，有人采用冷冻干燥包埋法(Freezedryingembeddingmethed),可以保存组织内可溶性物质，防止蛋白变性和酶的失活，从而减少了抗原的丢失。该法是将新鲜组织低温速冻，利用冷冻