实验1大肠杆菌的培养和分离 浙科版选修一

微生物微生物(microorganism)结构简单、形体微小的单细胞、多细胞或没有细胞结构的低等生物。例：酵母、霉菌、细菌、放线菌、病毒和小型原生动物等等微生物的利用：抗生素；酒；腐乳；污水治理……历史小资料

19世纪中期，关系到法国经济命脉的酿造业曾一度遭受毁灭性的打击。在生产过程中，出现了葡萄酒变酸、变味的怪事。经过一番研究，法国科学家巴斯德发现，导致生产失败的根源在于发酵物中混入了杂菌。

保持培养物纯净，保证无杂菌污染很重要！大肠杆菌的培养与分离一、大肠杆菌（E.coli）兼性厌氧的肠道内的共生菌群合成维生素B和维生素K，供机体利用；产生大肠杆菌素，抑制肠道致病菌和腐生菌滋生。革兰氏阴性菌作为一种工程菌，在基因工程技术中被广泛采用。例：大规模生产治疗糖尿病的药物——胰岛素培养基（culturemedia）

按照微生物对营养物质的不同需求，配制出的供其生长繁殖的营养基质。提供微生物生长的条件：合适的温度：25-37℃合适的pH：细菌6.5-7.5中性偏碱真菌5.0-6.0中性偏酸营养成分：含有碳源、氮源、生长因子、水和无机盐。关微生物营养物质的叙述中，正确的是A.是碳源的物质不可能同时是氮源B.凡碳源都提供能量C.除水以外的无机物只提供无机盐D.无机氮源也能提供能量

DLB培养基的配方固体培养基的配制：每50ml液体培养基添加1g琼脂琼脂？红藻中提取的多糖,在98℃以上熔化，44℃以下凝固，常温下凝结成有弹性的凝胶。凝固剂培养基种类

培养基（培养液）是由人工方法配制而成的，专供微生物生长繁殖使用的混合营养液。（1）按物理状态分：固体培养基和液体培养基、半固体培养基。（2）按功能分：选择培养基和鉴别培养基。（3）按成分分：天然培养基和合成培养基。1.培养基的类型固体培养基：菌落液体培养基：表面生长均匀混浊生长沉淀生长半固体培养基：无动力有动力(弥散)4.培养基的用途液体培养基：增菌、工业生产固体培养基：纯化（分离），鉴定、活菌计数、保藏菌种半固体培养基：动力检测培养基的分类液体培养基半固体培养基固体培养基选择培养基（抑制不需要的微生物生长）酵母菌、霉菌——青霉素金黄色葡萄球菌——高浓度食盐鉴别培养基大肠杆菌——伊红-美蓝培养基物理性质培养基用途．下面对发酵工程中灭菌的理解不正确的是A.防止杂菌污染B.消灭杂菌C.培养基和发酵设备都必须灭菌D.灭菌必须在接种前

B一、无菌技术1.无菌技术的概念

无菌操作泛指在培养微生物的操作中，所有防止杂菌污染的方法。1）无菌操作：各种器皿必需是无菌的各种培养基必需是无菌的接种时不能带入其他杂菌（１）消毒：指使用较为温和的物理或化学方法仅杀死物体表面或内部一部分对人体有害的微生物。（不包括芽孢和孢子）2.消毒与灭菌的概念及两者的区别

（2）灭菌：以物理或化学方法消灭所有微生物，包括所有细菌的繁殖体，芽孢等，而达到完全无菌的过程。芽孢有些细菌在一定的条件下，细胞里面形成一个椭圆形的休眠体，叫做芽孢。芽孢的壁很厚，对干旱、低温、高温等恶劣的环境有很强的抵抗力。(3)消毒的方法1、100℃煮沸5-6min2、巴氏消毒法:

70-75℃下煮30min或80℃下煮15min。适用于如牛奶、啤酒、果酒、酱油等不宜进行高温灭菌的液体3、用75%酒精、新洁尔灭等进行皮肤消毒4、氯气消毒水源5、紫外线消毒：如接种室空气……(4)常用灭菌的方法：1、灼烧灭菌2、干热灭菌：160-170℃下加热1-2h。3、高压蒸汽灭菌：100kPa、121℃下维持15-30min.4、不能加热灭菌的化合物，如尿素（加热会分解）：G6玻璃砂漏斗过滤（G6孔径最小，细菌不能滤过）接种环1.请你判断以下材料或用具是否需要消毒或灭菌。如果需要，请选择合适的方法。（1）培养细菌用的培养基与培养皿（2）玻棒、试管、烧瓶和吸管（3）实验操作者的双手答：（1）、（2）需要灭菌；（3）需要消毒。思考题灭菌锅检查水位设定高压温度及时间，121℃20min放入待灭菌物品加热，并打开放气阀排冷空气关闭放气阀继续升温升压待温度降低至80℃以下开盖，取出物品烘干无菌技术操作要点1、实验操作空间,操作者的衣着和手——2、微生物培养的器皿用具和培养基等——3、为避免周围环境中的微生物的污染，实验操作应在进行。4、实验操作时，应避免已经灭菌处理的材料用具与周围的物品相接触。……清洁和消毒灭菌酒精灯火焰附近微生物实验室培养的基本操作程序培养基配制器具和培养基灭菌倒平板微生物接种（斜面→液体）恒温箱中培养分离纯化（液体→平板划线）培养，菌种的保存（斜面）准备阶段培养阶段准备阶段LB培养基（用于培养细菌）1．称量2．溶化3．调pH：pH7．6

4．过滤：这一步可以省去。5．分装：分装过程中注意不要使培养基沾在管口或瓶口上，以免沾污棉塞而引起污染。分装三角烧瓶的量以不超过三角烧瓶容积的一半为宜。6．加塞、加封口膜7．包扎8．灭菌9．倒平板10．无菌检查：将灭菌的培养基放入37℃的温室中培养24—48小时，以检查灭菌是否彻底。称量蛋白胨酵母提取物NaCl液体LB培养基的配方

固体LB培养基每100ml液体LB培养基中加入2g琼脂，摇匀，灭菌。灭菌培养皿壁上不能沾有培养皿，否则容易污染。

1.培养基灭菌后，需要冷却到50℃左右时，才能用来倒平板。你用什么办法来估计培养基的温度？问题讨论

答：可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉锥形瓶的温度下降到刚刚不烫手时，就可以进行倒平板了。2.为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？

答：通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。3.进行恒温培养时，为什么要将平板倒置？

答：恒温培养时，培养基的水分会以水蒸气的形式蒸发，倒放培养皿会是水蒸气凝结成水滴留在盖上；如果正放培养皿，则水分形成的水滴回落到培养基的表面并且散开。如果培养皿已形成菌落，则菌落中的菌会随水扩散，菌落相互影响，很难再分成单菌落，达不到分离的目的。因此，恒温培养时，培养皿必须倒置。小结1什么是微生物？有哪些应用？2培养基的基本营养成分及其配制方法3无菌技术：消毒和灭菌（高压蒸汽灭菌法）4微生物培养的基本程序（倒平板技术）

微生物在自然界中呈混杂状态存在，要获得所需菌种，必须从中进行分离。在保藏菌种时不慎污染时也需予以分离。怎样纯化分离我们需要的大肠杆菌呢？